1、包被。包被抗原的性质很重要，关系到你做出的抗体可不可以被其识别，所以保存抗原很重要。小分子和载体蛋白偶联后才能吸附在固相载体上；包被液的选择一般选择Ph9.6的碳酸盐缓冲液。由于蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。

2、封闭。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填在包被过程中留下的空隙，比如后续加入的一级抗体也是蛋白，所以也会吸附在这些空隙中，从而对实验结果造成影响。常用封闭剂有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明胶和脱脂奶粉（5%－10％）；

3、洗板。ELISA操作中，洗涤是非常关键的一步，一般推荐洗三次，然后拍干。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，洗涤时可以将孔中残留的液体除去，尤其是加入抗体后的洗板过程非常重要，因为酶的高催化活性，洗板不彻底造成孔内残留一滴带抗体的液滴都会对孔内的颜色变得很深，推荐有条件的使用洗板机（因为做的板多了每次洗板拍板手会疼！哈哈）。

4、加抗体。注意确定一抗和二抗的工作浓度，尤其是HRP标记的二抗抗体，商业化HRP标记的二抗一般几百微升每管，价格比较贵。但效价会很高，可以稀释几千甚至上万倍都没问题，加上每孔一般就需要100μL，因此做ELISA前应需要特别计算抗体需要量（PS：刚开始做ELISA时没人带，自己摸索，结果酶标二抗一次就用了50μL，而且只稀释了几百倍，最后96孔板内的颜色真的是深到没朋友啊！）。

5、显色。商业化的显色底物有很多，价格也相对比较便宜，所以如果嫌配制比较麻烦的话可以购买，我们当时做的时候用的HRP标记二抗，然后买的TMB单组分底物显色液。

如果操作确实没有问题，可以考虑非特异性反应的发生，检查封闭操作。此外，酶标抗体的效价很高，实验前应该通过方法摸索找出最佳稀释倍数，否则浓度过高会造成孔内颜色过深，以至于没有区别；以及洗板不彻底。

全板呈黄色，分两种情况，一，黄色无梯度，考察你的抗原抗体是否特异性结合，以及样品是否受到污染，棋盘法确定抗原和一抗的最佳稀释倍数后，再对二抗的稀释倍数进行优化，过程中应注意洗板操作；二、黄色有梯度，考虑棋盘法重新对抗原，一抗的稀释倍数进行优化，二抗的稀释倍数是否合适，最后尽量使吸光度在1.0~1.5之间。

看说明书，可能你样品污染了，也可能是样品浓度太高，可以稀释一下。