2022-05-24 18:40:48

请教如何测定细胞抽提液中PKC的活性 ?

我想请教各位有没有直接测定细胞抽提液中PKC活性的方法,最好是非放射性方法,在网上看到的非放射性检测PKC活性的方法需要酶的纯化,不知有没有直接测细胞抽提液中PKC活性的方法,请各位大侠指教! 

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细胞生物学×

8个回答

我要用组化方法测PKC:1.方法:做好动物模型,取组织常规石蜡包埋,行冠状切片,片厚8μm。行免疫组织化学超敏(ultrasensitive,S-P)法实验,S-P试剂盒系NeoMarkers公司产品。免疫组化染色步骤:切片脱蜡;滴加过氧化酶阻断剂,室温下孵育10min;滴加兔血清,室温下孵育10min;滴加兔抗PKC抗体(1∶200,美国Santa公司产品),36℃1h;滴加羊抗兔IgG(1∶200),室温10min;滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液(1∶200),室温10min,以上各步骤后都用0. 01mol/L磷酸缓冲液洗3次,每次5min。DAB-H2O2显色。显色后常规脱水、透明和封片。替代实验,以与一抗血清同浓度的正常羊血清代替一抗进行免疫组织化学染色。 

2022-05-24 18:41:08

统计学分析 每例取6张PKC阳性细胞染色切片,在显微镜下(10×20),对PKC阳性细胞进行计数,测量面积为1mm2,每个部位随机测量3个视野,取其平均值。应用SPSS10.0统计软件包,采用t检验。

2022-05-24 18:43:26

我见过有人做过非放射性方法测定细胞抽提液中的PKC,但结果定量很难。方法就是用Promega公司的试剂盒,定量是将最后跑的电泳切下来,放于Ep管中,比色,个人感觉定量很不准,而且麻烦。
PepTag® 非放射性蛋白激酶检测 
V5330的组分
1ⅹ650 μl PepTag® PKC 5X 反应缓冲液
1ⅹ650 μl PFC激活剂5X溶液
1ⅹ0.5 μg 蛋白激酶C
1ⅹ650 μl PepTag® C1 短肽
1ⅹ10 ml 凝胶稳定溶液
1ⅹ250 μl 短肽保护液 
描述:PepTag® 非放射性蛋白激酶检测系统提供一种快速、灵敏,非放射性方法检测蛋白激酶C(PKC)或蛋白激酶A(PKA)的活性。PepTag® 检测法使用的底物是对PKC(PepTag® C1 肽-PLSRTLSVAAK)和PKA(PepTag®- A1肽-LRRASLG)高敏度特异的明亮的荧光肽。短肽的磷酸化使净带电从+1度成-1。这种净电量的改变使得磷酸化和非磷酸化的底物在中性pH的琼脂糖胶上快速分开。使用荧光检测,小于2ng的纯激酶可在2小时之内被检测。该系统既可检测半纯化样品,也可检测纯化的酶的激酶活性,是快速筛选层析组分、激酶激活剂和抑制剂的良好选择。除了检测组分以外,每一系统还含有做正对照用的纯化的激酶。
特点
● 非放射性:短肽底物的荧光标签促进了磷酸化反应的定量而不需使用放射性。
● 低背景:因为在激酶分析中使用的是系统提供的彩色短肽磷酸化底物,故样品中自然发生的其它底物的磷酸化不会被加进被检测的激酶活性中。
● 快速:经过电泳分离步骤就可快速确定磷酸化反应是否成功。
● 方便:光密度计,分光光度计,96孔板读数计或荧光计都可以进行磷酸化肽的定量。
应用
● 快速筛选有激酶活性的柱分离部分。
● 筛选激酶激活剂和抑制剂。 

2022-05-24 18:45:21

3H标记污染比较小,有液闪测定仪就可以。相对隔离就好,只要不把3H搞得那都是就可以了,还有,其射线比较低,一张纸就可以挡住,带一次性手套操作就可以,不用保护屏,比生化32P的污染小多了。只要不吃到肚子里就没什么大问题。 

2022-05-24 18:47:27

其实不用那么高,我用的上海安亭的机器,上到10000转就可以用了,同位素比较灵敏,没什么问题,不过时间上最好还是有20分钟以上比较好,如果用100000g离心60min,最好是外国离心机,机器不会坏的,不过会比较费时间和金钱,因为能上这么高的离心机太少了,一般使用费用比较高 

2022-05-24 18:47:56

有的抗体可以用冷冻切片,有的抗体可以用石蜡切片,看你做什么指标了,做之前一定问好了抗体适用于什么标本。一般搞病理的喜欢用石蜡切片,保存时间长,冷冻切片保留时间短,但我们办公室主要做鼠的脑子,觉的用冷冻的比较好。另外,好像有些抗体标明了只能用于冷冻切片。另外,冷冻切片和石蜡切片用的切片机也不同。 

2022-05-24 18:49:41

我现在就正在使用非放射性的PKC试剂盒 个人感觉割下凝胶条带去比色 简直是在开学校 根本肉眼就看不见颜色 而且将凝胶挖出时 要想全部挖出磷酸化了的 体积一定会超过它所建议的250微升
我用PKC标准品稀释一倍 跑了个电泳 倒是很完美呢 和它说明书上的一样 完全分开了 很清楚 
但就是这个高浓度的 我去比色 也只有0.075 空白是0.043
不过叫我高兴的是 我师兄一开始告诉我这个试剂盒17,000银子 结果吓的我都不敢随便做 每次就做一个样 结果今天一查 才不到2K 哼哼!!! 

2022-05-24 18:50:16

加拿大Immunechem公司的非放射性蛋白激酶C活性分析试剂盒安全、快速、稳定,可用于筛选蛋白激酶C抑制剂或激活剂、定性定量分析纯化或部分纯化的PKC激酶活性。
测试盒原理:基于ELISA的基本原理。PKC底物被包被在酶标板上,在ATP存在的前提下,PKC激酶将底物磷酸化,洗掉游离的PKC激酶和其他成分。再加入特异性磷酸化抗体(只识别磷酸化底物,而与非磷酸化底物无交叉反应。)检测残留在酶标板上的磷酸化底物。通过酶标二抗放大信号,读出OD值(蛋白激酶活性与OD值的对数成正比)。与对照组相比,得出处理组的蛋白激酶活性
(PKA, PKB, PKC, SGK, S6K和Tyrosine Kinase)等非放射性蛋白激酶分析测试盒http://www.immunechem.com

2022-05-24 18:53:25

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