2021-09-03 12:55:21

假设联合应用后出现通路蛋白磷酸化程度明显下降是不是进一步说明,药物可以作用于PI3K通路? 如果药物

我要设计PI3K/AKT/MTOR通路是否参与某药诱导细胞凋亡

思路如下:  一、 设计不同药物浓度、时间,观察药物对细胞凋亡的影响,WB检测通路蛋白磷酸化程度,看药物能否调控PI3K通路。二、 采用抑制剂LY294002 、rapamycin联合药物干预,浓度采用IC50,假设得到如下结果:

图片3.png图片4.png

假设联合应用后出现通路蛋白磷酸化程度明显下降是不是进一步说明,药物可以作用于PI3K通路? 如果药物和抑制剂联用后细胞凋亡明显增加,是不是说明PI3K通路参与了细胞凋亡的调节?


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细胞生物学×

6个回答

你目前的实验只能表明药物和AKT signaling之间有相关性,要证明直接作用,还需要进行过表达和Knockdown的验证实验 1. 过表达constitutively active AKT 质粒,看是否能rescue药物的作用,同时看mTOR的磷酸化状态; 2. 比较AKT-siRNA 和AKT-siRNA + 药物之间的差异;比较Negative control和Negative control + 药物之间的差异,进一步判断AKT信号通路对药物作用的重要性,或者是药物作用对AKT通路的依赖程度。


2021-09-03 12:55:45

我认为是可以说明的


2021-09-03 12:56:23

Addgene上有constitutive active的质粒


2021-09-03 12:56:45

AKT抑制凋亡已经做很多了,我觉得再去做caAKT rescue没什么意义,si更有说服力。


2021-09-03 12:57:03

嗯,另外我觉得需要标明rapamycin的量才好看看是否反映凋亡,过量的rapamycin可以激活自噬进而诱导自噬性凋亡,另外一般认为是Akt-PI3K-mTOR,这一轴顺序,因此你的药物是作用于Akt磷酸化之前还是mTOR磷酸化之前,我觉得还是挺有趣也挺费思量的


2021-09-03 12:57:25

觉得设计不合理,不能说明问题。


2021-09-03 12:57:43

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