2021-01-10 07:12:27

PCR产物与所用质粒酶切后回收的问题

请教各位高手一下:我用两种限制酶分别酶切PCR产物和相应的质粒,在进行连接之前,有必要分别回收后再连接吗?注:我扩增出目的基因后已经进行PCR产物的回收.


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分子生物学×

5个回答

可以不切胶回收,你最好将pcr酶切体系抽提沉淀一下,要不然酶切体系中的杂质会影响你的连接


2021-01-10 07:12:58

我认为应该切胶回收。抽提沉淀是可以去掉部分杂质,但是,从载体上切下的片段也一样会沉淀下来,这样会影响目的片段与载体的连接及阳性克隆的筛选工作


2021-01-10 07:13:23

质粒酶切后建议把要的片断回收,连接体系中片断越小其连接到载体上的竞争性越高,因此如果不回收的话载体本身切出的小片段很容易的连回去,产生大量的假阳性克隆


2021-01-10 07:13:45

可以根据酶切后产生的片段大小来考虑是否需要凝胶分离回收,如果酶切后释放的片段很小比如20-30bp,可以通过酚氯仿抽提后用醋酸铵乙醇沉淀的方法去除小片段。否则必须经过胶回收来纯化。一定不能抱侥幸心理不做纯化。值得注意的是,大多数情况下,凝胶回收的效率比沉淀法要低20%-60%所以如果做凝胶回收的话应考虑制备足量的原始产物,同时最好在电泳前先进行一次抽提沉淀,这样电泳时不会由于样品中的离子导致电泳分离效果不好,再要分离条带大小接近时这一点尤为重要。


2021-01-10 07:14:06

  1. 一般情况下,PCR产物酶切可以直接进行PCR纯化试剂盒回收(胶回收效率40%左右吧,损失比较大)

  2. 目的载体(质粒)一般采用胶回收,同时在酶切后,可用碱性磷酸酶处理载体,去掉5末端的磷酸基团,能放置载体自连。

2021-01-16 11:48:57

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