p-Akt WB条带有问题，怎么解决？

我最近在做WB，染的是大鼠心肌P-AKt，出来的是2条带
5% milk TＢST封闭１ｈ，碧云天一抗稀释液稀释，1:2000（CST 4060 p-AKT【ser473】）， TBST洗10min*3次，中杉兔二抗，1:5000稀释，TBST洗10min*3次，结果是

微信截图_20180201094329.png

后来越做越差，出白板了！请大家给个建议！

信号转导

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估计是抗体的原因，可以问一下你们实验室其他人做的情况怎么样，或者使用过这些抗体的师兄师姐怎么说的

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2024-04-14 13:08:44

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你做的是磷酸化蛋白的WB，建议每次都用新鲜样本做，另外需要加用磷酸酶抑制剂，不然磷酸化的蛋白都降解了，当然做不出结果

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2024-04-14 13:09:01

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CST的p-Akt(ser473)抗体质量还是蛮好的，而且看说明书是60Kd的一条带，为什么你那边有两条？你的条带对照marker大小对吗？
看你的流程上没什么问题，一般出白板，首先检查的是一抗、二抗的质量。
当然因为你做的是磷酸化的抗体，phosphatease的inhibitor肯定要加的，相信你自己肯定知道的。

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2024-04-14 13:09:21

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一抗是磷酸化的抗体，提蛋白时需要加磷酸酶抑制剂，封闭时需要用BSA。

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2024-04-14 13:10:47

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提问时间：	2024-04-14
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p-Akt WB条带有问题，怎么解决？

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