是不是其一考虑胰酶消化时间过长，其二或是传代时间延迟了，一般铺满瓶底70％多左右就可传代了，否则其后细胞易老化，其三考虑传代时离心过度损伤细胞。因为我前后都出现过这些问题，自己慢慢摸索出来一些浅显的认识，希望有帮助。

个人觉得1.老鼠年龄小的时候（<2M)用直接贴壁法比较好，但要注意最好在第2或3天的时候换液，因为这个时候的小鼠骨髓里面MSC的含量较多，用直接贴壁法可以减少对细胞的损伤。
2.用DMEM和MEM来说应该区别不大，胎牛影响相对大些，国外的还是要比国产的好的多
3.原代还是等长的比较满的时候传代比较好，因为原代里面本来就混有杂细胞；细胞变宽也可能是因为细胞数量少引起，最初你见到的贴满瓶底的不一定是MSC，有可能是成纤维状的其他细胞，所以需要2，3天的时候换液。

年龄>2W时用离心贴壁比较好，因为这个时候随年龄的增加，大鼠的MSC含量相对减少，此时离心后能相对纯化一下细胞。换液我觉得第7天比较合适，但如果是狗，人，或者兔的MSC，觉得第3天就可以换液了。感觉大动物的MSC贴壁，增殖都较好。自己分析可能是大鼠分离出来骨髓的量本来就较少。

建议1 用aMEM培养，2原代种植细胞密度可增大，3不用等到70％传代，50％左右就传代，因为MSC很容易老化，或者有可能向一个亚系分化，4加适量的生长因子，但是前提是不