还是分开看吧。AKT的总蛋白能做出来应该转膜没问题，473是它主要的磷酸化位点，一般也检测这个位点。不过它并不一定在所有的肿瘤里都会上调。磷酸酶抑制剂是需要的，并不是因为不加就肯定做不出来，而是做出来的结果会容易不稳定。所以如果你做几次都做不出来，也许真的是不表达。还是建议你加一个阳性对照的样品来排除抗体的质量等因素。可以拿个普通的细胞拿胰岛素等刺激一下就可以诱导AKT的磷酸化。egfr的总蛋白表达量一般还蛮高的，但这个蛋白分子量很大，如果总蛋白没做出来，那最大的可能是转膜没有转好。不知道你有没有预染marker上有200多kd条带的那种，可以辅助你鉴定转膜效率。转膜完以后还要再染下胶，看看大分子量的蛋白有没有转过去。做这样的蛋白，胶浓度不能大，一般8%左右最好。

首先要考虑裂解液问题，确定裂解液完全没有问题，没有磷酸化的蛋白一般比较稳定，容易出结果，不能说明裂解液是好的，还有抗体稀释液注意不能用脱脂奶粉，磷酸化蛋白会与脱脂奶粉中的成分结合，影响结果，最后看看上样量啥的。

CST的抗体应该没啥问题，300mA太高了，容易过热，建议200mA 3-3.5h，8%胶，分离胶75V 浓缩胶120V电泳要置于冰上（与转膜一样）， 0.5%TBST洗膜，2.5%BSA稀释抗体。

我做过P-EGFR的WB,效果很好啊。大分子量的蛋白电泳时用8%的分离胶，跑胶时要注意电泳时间的控制，多注意MARKER的位置，等目的蛋白的位置大约在胶的中下方时停止电泳。