2019-08-12 13:22:09

激活了信号通路,该检测哪个蛋白才能证明确实激活了?

常用的几个信号通路,NFKB,TGF-beta,WNT,,假如我用激活剂激活了这些信号通路,那如何证明信号通路确实被激活了?除了报告载体以外,用western检测哪些关键蛋白,才能证明确实激活了?


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3个回答

(1)western主要检测信号系统中的蛋白磷酸化水平,如果磷酸化水平升高则说明蛋白激活了。(2)另外还有检测NF-kB和DNA的结合水平,主要采用EMSA,和报告基因的方法。(3)检测TNF,IL,iNOS,COX-2的mRNA表达(RT-PCR)。(4) 检测IkB的磷酸化,泛素化和降解(IP,Western)。(5)需要检测的蛋白主要包括:IKKa,IKKb,IkB-a,NF-kB,Akt,TAK1,TAB1,TAB2,NF-kB,COX-2,iNOS等。

 


2019-08-12 13:22:31

如果你想研究机制,也就是你的外源性刺激是怎么激活某个通路的,我认为是从上到下做,配合好工具药物和各种干扰手段,如果就是想看个结果,也就是看哪个通路被激活了,那就测个下游信号吧。但是,你要知道,因为很下游,所以受到调控的因素会很多,而且信号被放大很多,同一个刺激完全可能会激活很多种下游信号。比如比较下游的ERK,Gi,Gq,Gs,TKR,都可以刺激MAPK,不管是直接的还是间接的。另外检测的时间非常重要,转录调控中有快反应的,有慢反应的。


2019-08-12 13:22:51

关于Wnt信号通路我想再补充一下:1、Wnt信号通路有三条:经典的Wnt信号通路、PCP通路和Wnt钙离子通路。PCP通路的下游基因由c-Jun和JNK,可以检测他们的磷酸化水平。而Wnt钙离子通路的研究不是很清楚,主要跟细胞内Ca2+的释放有关。2、经典Wnt信号通路主要是通过beta-catenin与TCF蛋白家族成员(包括TCF1、LEF-1、TCF3和TCF4)形成转录激活复合物,激活包括cyclin D1在内的下游靶基因的转录。要检测该通路的激活可以检测Lef-1或TCF(如Top/Fop系统)荧光素酶报告系统的活性。另外还可检测游离beta-catenin的含量的变化;如果只检测蛋白水平变化的话,建议检测核内beta-catenin的变化,只有核内beta-catenin的水平才表示Wnt信号的激活与否(核内beta-catenin升高表示Wnt信号激活,反之,抑制)。另外也有检测beta-catenin磷酸的,但磷酸化beta-catenin被E3连接酶识别,然后被降解,所以若外界刺激激活了Wnt信号通路则磷酸化的beta-catenin的水平降低,而总的beta-catenin的水平应该是升高的。

 


2019-08-12 13:23:10

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