2018-10-14 15:56:38

如何说明两个蛋白之间的关系?

求教各位师兄师姐们,我想检测一肿瘤细胞的一种蛋白对另一种蛋白的影响。我只干扰其中一个蛋白的基因,使其蛋白降低,然后导致了另一种蛋白的表达降低。这样可以说明这两种蛋白之间的关系吗?还需要做过表达吗?谢谢

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肿瘤与细胞×

4个回答

RNA干扰;向细胞中导入针对基因A的siRNA或shRNA→基因A的mRNA降解→导致基因A的蛋白质降低→表型变化(如基因B降低);恢复实验的逻辑;如果表型变化确实由基因A的蛋白质降低所致,那么将基因A的表达水平恢复到正常状态,表型变化应当消失。恢复实验的原理:重新向细胞中引入对干扰不敏感(RNAi-Insensitive)的基因A的mRNA→导致基因A的蛋白质恢复到原来的水平→表型变化消失;首先要构建对干扰不敏感(RNAi-Insensitive)的基因A的表达载体(核酸序列不全一样,但是表达的蛋白质完全一样。网上的资料很多),它对基因A的RNAi不敏感,不会影响基因A的RNAi发挥作用(包括特异性和可能的非特异性作用)。不能够使用野生型,原因是:野生型是RNAi的靶子,表达野生型可能起到“中和”RNAi的作用,相当于降低了RNAi的剂量或RNAi的效率,即降低了RNAi的作用。蛋白B不用做恢复实验。

2018-10-14 16:01:07

该实验设计有很好的内在逻辑,我简单的说一下,这种RNAi-resistant construct 的外源过表其实简单来讲是在同一模型敲低基因A后再恢复基因A的表达。
重要的是,该实验是在同一细胞模型下的回复实验,非常有利于证明基因A的作用。
以乳腺癌研究为例,通常分为雌激素受体ER阳性和ER阴性的细胞系,如果Gene X只在ER阳性细胞系表达,也即X可能依赖于这种大环境或者说雌激素信号发挥作用,那这时候在ER阴性细胞系里过表达GeneX有可能是没有用的,但是在阳性细胞系里用靶向X基因 UTR区域的siRNA处理后再将X过表回去,将明显产生表型恢复及信号通路和下游信号分子的表达变化。一言以蔽之,有表达则有功能。一个功能基因发挥作用,受细胞遗传背景和表达模式影响。在一个不表达该基因的模型里面外源表达该基因,其意义远不如在有表达的细胞系里开展诸如本话题讨论的实验。
类比来讲,将一个公司经理去职后,其公司业绩会受影响,返聘后业绩恢复,但是把该经理放到一个扫厕所的部门并不对厕所卫生产生明显影响(当然更不能对业绩产生影响),所以把经理放在公司这个他本身就存在的大环境下研究才是有意义的。
希望对诸位朋友有所帮助。


2018-10-14 16:11:14

首先, 由于常见的非特异性,逻辑上讲,必须通过恢复实验(Rescue Experiment),证明RNA干扰的结果。 这个实验就比过表达实验复杂。此外,又要排除干扰素效应对蛋白质合成的非特异性抑制。
证明了RNA干扰的结果后,就向2楼说的,证明中间的机理

2018-10-14 16:39:21

不知道你们对这两个蛋白质有没有做过其他实验,如果单就这个结果来讲,有意思,但还不足以说明什么问题。如果能想办法搞清楚内在的机理,才能算是一个故事,现在仅仅是故事的开头。而且需要找一个合适的理由来说明为什么要做那个蛋白质的干扰。一般来说,如果想要搞清楚内在联系,99%可能需要做一些过表达相关的试验。

2018-10-14 16:41:09

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