2019-07-05 08:31:11

TLRs-NF-kB的激活测定?

(1)我的动物实验也设计了测定TLRs-NF-kB通路的激活情况,由于没有条件EMSA,只能做WB。想通过提取全蛋白,WB测TLR2/4、磷酸化p65含量,这样是否科学?浏览了好多帖子,说法不一,有说要分别测胞浆内和核内磷酸化p65,也有说要结合IHC,我现在很困惑,希望得到帮助,谢谢。

(2)Curcumin Inhibits TLR2/4-NF-κB Signaling Pathway and Attenuates Brain Damage in Permanent Focal Cerebral Ischemia in Rats 一文中,p65的测定是采用全蛋白提取后 a mouse monoclonal antibody against NF-κB p65 (1:200, Santa Cruz, USA),不清楚是否采用磷酸化抗体,并结合免疫组化。
(3)查阅了abcam的磷酸化p65一抗,发现有多个磷酸化位点,应该如何选择?


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3个回答

  1. 1、关于NF-kB通路激活,看你目标杂志的档次。
    a. EMSA:个人感觉JBC上的关于说明NF-kB通路激活的文章,有些使用了EMSA,有些没有使用。b. 免疫荧光:我所看到的大部分涉及激活NF-kB通路的文章都是用免疫荧光来显示p65入核情况,这个比较直观,做起来难度不大;c. WB:我看的文章大部分都用了这个,最好是分别提取胞浆和核蛋白做,这样比较清晰。也是看目标杂志档次,JBC及以上的话,最好做了,免得reviewer到时候给你挑刺,并且个人感觉这个刺很容易挑。如果杂志定位低一点,也有可能用whole cell extract来做,估计能混过去。d. 我自己有2篇不到3的文章也涉及到NF-kB通路的激活情况,用的指标是IF(p65入核)+WB(whole cell extract测pIKK,IK,p65)来说明的,reviewer没有说啥,不过我这两篇的工作都是在细胞上模型上做的。

  2. 2、 WB测p65的话,肯定测定的是磷酸化的p65,p65平时在胞浆,经典看法是外界刺激激活上游的IKK,IK,IK解除对p65的抑制,p65磷酸化后入核,调控下游基因表达。买p65的抗体时最好买那种可以同时测IHC和WB的,这样方便你测定IHC和WB。

  3. 3.、至于哪个公司。我当时用的是CST的,没用过abcam的,不过业界普遍认为abcam质量比较好。有个办法可以帮你选择哪个公司,就是去搜哪些文章里用的这两种公司的抗体多,文章档次越高,一般可信性较大。
    加油!



2019-07-05 08:34:08

 1. 我没做过你这方面的工作,不能给出直接的建议。但是有个办法就是在google scholar上,输入关键词,例如“anti-p65 (abcam)”或者“anti-p65 (cell signaling)”等(关键词你可以自己组合,例如加上你的疾病模型等等。),会出现很多直接相关的文献,并且往往都是引用率很高的经典文献,你一条一条的看,如果能找到和你相关的文献,那就有助于你判断购买哪家产品。
个人感觉经典标杆期刊如blood,JBC等的文章所采用的抗体是比较有说服力的,尤其是JBC上的杂志,method部分写得非常详细,很扎实,多注意这一部分。
ps:在这里忍不住赞一下google,真是个伟大的公司!“站在巨人的肩膀上”,说的真没错,你用的越久,对其深刻含义就越理解,没事多琢磨琢磨这个google,很有帮助。

2. 给你说一下我做过的关于这个通路的检测吧,或许能提供一点参考。
我当时是在建系的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞、小鼠原代腹腔巨噬细胞、分化的神经母细胞上做的NF kappa B通路激活情况,买的是CST公司的p65(p-p65,p65),应该是100 ul的包装,检测方法用的是WB和IF(免疫荧光),效果比较正常。分别发了几篇不到3的小文章,这几篇文章的审稿过程中,没有一个reviewer提出关于抗体方面的问题,也从侧面说明,应该算认可的。

3. 具体抗体。我没用过Abcam的,当时买不起,CST的也用着觉得可以。


2019-07-05 08:36:22

(1)我当时做的主要是在细胞层面的,你在动物整体层面可以用多种方法,例如IHC就比较直观。

(2) WB时胞浆和胞核蛋白的内参不一样,这个你可以搜一下JBC的文章,JBC上面生化的指标一般比较扎实,参考性强。最终目标是检测胞浆和胞核里NF-kB的磷酸化水平。

(3) p65我只用过CST,还行,其它的还没用过。查询抗体时在说明书的application内有列表。


2019-07-05 08:38:24

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