2020-07-11 21:41:03

如何解决4 kb片段连接pcDNA3.1+的问题?

最近忙于质粒构建,意图将一段长约4000 bp的片段,通过BamH1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下:
1. 通过LA Taq酶扩增,并纯化回收目的片段(引物中带有酶切位点,保护性碱基=3,上游带有Kozak序列);由于回收效率很高,所以在进行下一步双酶切时只加了12 μl的目的片段,H2O 20 μl,10 X K BUFFER 4 μl,两种酶各2 μl,37℃作用过夜(12-14 h),再进行胶回收。

2. 载体pcDNA3.1提取质粒后,也按照以上的体系进行双酶切,时间为6 h。

3. 将酶切后的木点片段和载体均取2 μl进行电泳,结果显示大小与预期相符,亮度相近。

4. 连接时,目的片段:载体=4--10:1(因亮度相近,所以按照体积比)都做过,10 μl体系和15 μl体系都尝试过。5. 感受态为新制备的JM109,转化效率没有具体测过但别人用后均连接成功,阳性质粒眼观转化效率很高。
6. 限制性内切酶为TAKARA,T4连接酶是国内一家小公司的产品,不过实验室一直用,效果一直有保证,同期进行连接的其他同学也都连接成功。结果:转化后,平板上均有数量不等的菌落产生,少时4-5个,多时10来个。摇菌扩增8 h,进行菌液PCR检测(含阳性对照),检测组无阳性结果,但一直在1000 bp左右出现较弱条带,阳性组正常。提取质粒后,10 μl体系双酶切2 h,竟然在2000 bp和3000 bp处出现较弱条带(比Marker稍暗)。请指点迷津。如果有效果好的、适于长片段连接的方法,也请大家指教,多谢。


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6个回答

 看了下你的情况,我有几个问题:1)为什么选用BamH1和EcoR1两个酶切位点?从pcDNA3.1+载体图谱上看,这两个酶切位点相隔太近,你用双酶切载体制备vector的时候,如何确保两个位点的酶切充分完全?我的建议是,如果不想换酶切位点,线性化载体的时候就采用单酶切的方法,先切EcoRI,取少量产物跑胶确定已经线性化,再切BamHI,胶回收酶切产物。另外,如果时间和经济允许,目的片段序列也允许,建议换用HindIII+XhoI这两个酶切位点,NEB的这两个酶是可以双酶切的,我用这两个位点已经构建了几十个constructs了,屡试不爽。2)是否有设置自连对照?这个问题实际上是上一个问题的延续,本质上就是检测载体双酶切的效率如何,根据自连对照克隆生长情况,还可以大致推断整个连接系统是否有效,以及感受态的效率如何。不知道你有否设置自连对照。如果有,那么自连对照的克隆生长情况如何?有没有提质粒跑胶看看片段大小?3)我从来不用PCR来鉴定克隆。这个也跟个人喜好有关吧,我总觉得这种方法太容易产生cross contamination。我比较喜欢用in gel screening这个方法,省事省时,而且很直观。4)最后友情提示一下,凡是构建constructs的所有电泳和胶回收操作,一定要使用新鲜的TAE buffer,而且一定要用新鲜的双蒸水配制。4kb的insert虽然有点大,但是难度还不是最大。


2020-07-11 21:47:55

 要先确定你那么长的片段当中不含有这两个酶的酶切位点。但一直在1000 bp左右出现较弱条带,应该是非特异条带。还有就是酶切产物最好都进行电泳后回收,以免载体切下的片段又连回载体上,降低了成功率。如果实在不行的话,考虑TA克隆。

2020-07-11 21:52:43

BamHI、EcoRI可以的,我做过。
载体和片段都是胶回收的?在回收片段纯度没有问题下考虑以下因素1、 克隆长得少可能表示载体酶切尚可,很可能片段酶切得不好。合成的引物是否完整?上面的酶切位点是否正确?如果时间允许,克隆到T载体上再酶切。很多PCR产物酶切连接不上的问题克隆到载体上后再酶切都没有问题了。2、片段测过序吗?内部是否有这两个酶?


2020-07-11 21:53:37

如上所述,TA克隆的确是长片段亚克隆的好的手段。我最初开始学习构建质粒的时候也是先上TA,不过我们实验室一直使用一种KAPA HIFI readymix的酶,效果很好,保真性也非常非常高,就是做TA的时候比较麻烦,需要把PCR产物纯化回收后再加一次A tail,而就是这一步我感觉一直没有摸索到最优化稳定的条件,所以每次加A后连pCR2.1;转化的结果都不稳定,有时候长的多有时候长得少,之前曾经就这个问题发帖向大家请教过,有战友反应这一步其实很简单,没什么很难得因素。但是不管怎样,我现在对长片段的TA克隆是有心理阴影了,所以我一般都是直接设计带酶切位点的PCR引物,扩增出目的片段后直接酶切再连目的载体,至今还没有做不出来的。再次祝你好运,有进展记得与大家分享。


2020-07-11 21:55:51

 4KB的PCR产物片段直接双酶切克隆,要靠运气了。强烈建议TA克隆,测序OK后,再换载体,这样的话成功率才会高。你需要确认几点:1,PCR产物两端的酶切位点在不在;2,筛选阳性克隆时,不管是菌落PCR还是质粒酶切,由于片段与太大,都不好去判断。建议:如果是PCR鉴定,则可以在中间设计一条引物,与目的载体的一条通用引物进行配对,扩增出来的大小为1k左右,这样便于判断。如果采取酶切方法鉴定,建议在片段中选取内切酶,只要切出来的大小符合我们理论上的要求即可;3,克隆时阴性对照非常重要。


2020-07-11 21:56:51

我建议你先进行T克隆...要是直接pcr会很困难的...而且表达量也会特别的低...

2020-07-12 18:54:39

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