2018-07-31 13:56:25

为什么每次做流式 annexin v 的双染凋亡实验,每次都测不出有凋亡的存在?

我用了一个人工合成的凋亡诱导剂,诱导胃癌细胞收蛋白后 caspase3的剪切条带随着药物浓度的增高逐渐增高,考虑确实有凋亡的存在,但是不知道为什么每次做流式 annexin v 的双染凋亡实验,每次都测不出有凋亡的存在,究竟是为什么?是不是 caspase3能杂到,流式双标凋亡就一定能测的出来,这个流式双标实验有什么要注意的,比较药物刺激时间,我用 IC50的浓度做了24h 和48h 的都测不到凋亡,请教各位!


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4个回答

别着急:做过凋亡的方向,说说我的经验:1、凋亡金标准是WB的cleaved casp.3,如果这个都能做出来,说明凋亡肯定存在。2、流式也是表象的金标,但是流式会延迟不少,也就说,AV染色的时间往往延后。比如24h肉眼看到不少细胞漂起,去做WB,如果抗体好,一般会有cleaved条带,但是AV流式染上的比例可能会比较低。这时候,延迟时间,或者增加药物浓度往往会很明显。3、上述要建立在正确操作的基础上。做流式凋亡容易出漂亮的图,但是几个操作很关键。试剂盒最好买BD的,一定要用试剂盒里的缓冲液,里面有钙离子;同时孵育一定要在室温,冰敷染不上。4、如果上述都具备,应该还好做的。
祝顺利。


2018-07-31 14:53:36

1、av和pi两种染料,av是通过染膜蛋白看凋亡的,所以最好用加药组来做这管,这管用来调节补偿,最好要两群分明,所以与你处理浓度和时间无关,分开就好,对后面没有任何影响。pi正常组,也能分群的,所以没有必要用加药组。2、24h在形态上才看出部分细胞凋亡? 这句话就能看出,你多半染不上。其一,24h时你才能看出部分细胞漂起吧,而凋亡流式是比较滞后的,我的个人经验是一般看到大量细胞漂起,比如大概肉眼看有60%细胞飘,而av也就能染上20-30%就不错。而你单单肉眼才看到部分漂起,说明作用时间估计差一些,染不上。 建议你再增加时间,比如36h,48h。有一次细胞几乎全飘了,我也去做了下,发现也就60%凋亡率,所以漂起的细胞不一定能被全染上,但不飘的细胞肯定染不上。


2018-07-31 15:06:20

 做流式的时候,培养液里面漂浮的细胞收集了吗?也有可能是wb的敏感性较流式高,建议换个试剂盒进行流式检测


2018-07-31 15:07:01

缓冲液有Ca+离子,这个非常关键,因为AV只有在他存在下才能结合。
最好用不含EDTA的胰酶,因为EDTA会损伤到膜,导致假阳性的出现;但是根据经验,也不会损伤很大,自己操作时稍微不要太用力吹打即可。


2018-07-31 15:07:36

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