2018-08-01 12:31:33

是否要筛出稳转细胞系再进行rescue?

瞬转shRNA knockdown有表型了,如果做rescue的话是否要在得到稳转细胞系再转染过表达质粒?


回答 0 评论
您已邀请来回答问题
细胞生物学×

4个回答

可以瞬转,但是需要将新导入的蛋白质同内源性蛋白质区分开来,例如,新导入的蛋白质带3XMYC标签。将新导入的蛋白质与shRNA共同瞬转,用针对内源性蛋白的抗体做Western。证明内源性蛋白降低,新导入的蛋白质表达。


2018-08-01 12:39:11

不只是加标签的问题, 一般要在WT表达载体上结合shRNA的识别位点进行无意突变,防止rescue的mRNA 被shRNA识别并降解 


2018-08-01 12:40:11

当然做是最好了 一般可以不做
做的话 按我的经验
shRNA选UTR靶点的 这样rescue后 就不需要做突变了
(如果shRNA靶点在CDS区,做rescue就需要突变对应的靶区)


2018-08-01 12:41:05

这个rescue实验看什么,如果只是针对sh A的话,你需要狗年一个不能sh a靶向的突变体,如果a靶向utr区域,可直接转入cds的正常表达载体,如果a靶向cds,那需要构建不能sha靶向的突变,这个设计引物做就可以。还有一张rescue是针对a下游的某个蛋白b,这个蛋白就是本课题所涉及的信号通路,那直接可以构建b过表达或敲出稳定细胞系,然后根据你的前期实验,瞬时oe/kd a即可。

2018-08-02 14:32:30

你的回答