2023-09-10 05:24:19

大分子量蛋白EGFR和磷酸化的蛋白 P-EGFR和 P-AKT做不出来

做Western,摸条件,出现各种问题,现在主要问题是大分子量蛋白EGFR和磷酸化的蛋白 P-EGFR和 P-AKT做不出来,什么原因呢?提蛋白时有加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。内参和AKT其他蛋白都出的很好。大家有做过大分子量的蛋白和磷酸化蛋白的大侠,有什么经验可以分享下吗?

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3个回答

首先要考虑裂解液问题,确定裂解液完全没有问题,没有磷酸化的蛋白一般比较稳定,容易出结果,不能说明裂解液是好的,还有抗体稀释液注意不能用脱脂奶粉,磷酸化蛋白会与脱脂奶粉中的成分结合,影响结果,最后看看上样量啥的。

2023-09-10 06:14:00

我做过P-EGFR的WB,效果很好啊。大分子量的蛋白电泳时用8%的分离胶,跑胶时要注意电泳时间的控制,多注意MARKER的位置,等目的蛋白的位置大约在胶的中下方时停止电泳

2023-09-10 06:16:54

AKT的总蛋白能做出来应该转膜没问题,473是它主要的磷酸化位点,一般也检测这个位点。不过它并不一定在所有的肿瘤里都会上调。磷酸酶抑制剂是需要的,并不是因为不加就肯定做不出来,而是做出来的结果会容易不稳定。所以如果你做几次都做不出来,也许真的是不表达。还是建议你加一个阳性对照的样品来排除抗体的质量等因素。可以拿个普通的细胞拿胰岛素等刺激一下就可以诱导AKT的磷酸化。egfr的总蛋白表达量一般还蛮高的,但这个蛋白分子量很大,如果总蛋白没做出来,那最大的可能是转膜没有转好。不知道你有没有预染marker上有200多kd条带的那种,可以辅助你鉴定转膜效率。转膜完以后还要再染下胶,看看大分子量的蛋白有没有转过去。做这样的蛋白,胶浓度不能大,一般8%左右最好


2023-09-10 06:37:26

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