2020-09-16 13:53:28

如何测定Tm值?

最近合成回来一批PNA(DNA的类似物,只是骨架不同),因为不能对PNA测序,所以无法判断PNA的序列是否正确.今想到可以用测定PNA/DNA 双链Tm值的方法来验证,因为如果PNA序列有误,则其与互补DNA的Tm值肯定下降.
有无大牛给指条明道,哪怕是 DNA/DNA的Tm值是如何测的(包括仪器和操作,以及所需核酸量),也好有个借鉴.另外,可否使用Realtime PCR仪器呢?


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细胞生物学×

5个回答

TM for oligo
G or C = 4
A or T = 2


2020-09-16 14:02:38

一点建议: 我觉得你的想法可能有点行不通,测Tm值,我好像没听说过,即使测的话,也会有一定的误差,如果就是有合成错的,只差一个碱基Tm值也不会有太大的改变。所以建议你合成时找一个信得过的公司如Invitrogen(我不知他们是否合成PNA)就行了,不用再怀疑了。


2020-09-16 14:09:08

我觉得理论上是可行的,在做定量PCR的时候,最后的步骤都是做产物的溶解曲线是否是单峰以了解扩增的产物是否较纯,新一代的定量PCR可以进行高灵敏度的溶解曲线的分析,理论上只要有一个碱基的差异,就会造成Tm的不同,从而发现一些产物的多态性和突变,但是本人自己没有做过这个步骤,也不知道真正做起来是否可行,但是你可以尝试一下。


2020-09-16 14:13:07

引物的Tm值可以计算的。经验值是:
在引物合成单上,合成引物的公司一般都会把上下游引物的Tm值标出来。记住不是【1M】Na离子的TM值啊!上游引物的Tm值+下游引物的Tm值/2-3度或者5度。算出来的是个温度范围,你最好用梯度PCR探索一下最佳的退火温度(Tm)。我们实验室都这样估算的,很好用的!建议你试一试啊!这比计算A,T,C,G要简单的多。


2020-09-16 14:15:01

最准确的方法是用量热测的,比如DSC,可以很准确得到Tm,但是需要特殊仪器。
其它方法也常用,比如测CD信号在不同温度下的值进行拟合,大致的估计也可以。这个方法比较容易。


2020-09-16 14:15:43

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