2022-05-24 17:40:51

怎么才能做出那种ladder样的条带?

请教各位,我最近在做泛素化检测的实验,主要是调控了一个泛素连接酶(E2)的表达后观察下游一个分子泛素化的改变,用的Bio-Rad的磁珠做的Co-IP,细胞预先用MG-132 10uM处理了6小时,用下游那个分子的IP抗体去沉淀,然后用Ub的抗体去做的WB,差异是有的,但是没有出现那种ladder样的条带,只有一条带。这个要怎么才能做出那种ladder样的条带?需要再转个HA-Ub的质粒进去吗?


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蛋白质组学×

4个回答

你可以加 NEM 抑制 去泛素酶(DUB)的活性,或者干脆用 denaturing IP 去拉目的蛋白,然后检测泛素化。如果真的很难做,可以试试看过表达目的蛋白,再 IP ,当然无论如何也要用 NEM 或者 denaturing IP.


2022-05-24 18:26:11

你可以首先参照那片文献修正自己的实验。蛋白质跟蛋白质不一样,不一定都有 ladder ,有 smear 也不错。印象中,ladder 常出现在体外泛素化反应中。另外 denaturing IP protocol 可以在 pubmed 上找到。


2022-05-24 18:30:55

内源性的泛素化本来就低,用MG132预处理后再提蛋白,可能好点,最好还是转一个Ub进去。

2022-05-24 18:35:28

还是加NEM,另外看看泛素化靶蛋白的降解时间,有些一两小时就降解完了,将要不然做不出来

2022-05-24 18:38:14

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