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2023-05-29 09:30:22

怎么才能做出那种ladder样的条带？

请教各位，我最近在做泛素化检测的实验，主要是调控了一个泛素连接酶（E2）的表达后观察下游一个分子泛素化的改变，用的Bio-Rad的磁珠做的Co-IP，细胞预先用MG-132 10uM处理了6小时，用下游那个分子的IP抗体去沉淀，然后用Ub的抗体去做的WB，差异是有的，但是没有出现那种ladder样的条带，只有一条带。这个要怎么才能做出那种ladder样的条带？需要再转个HA-Ub的质粒进去吗？

蛋白质组学

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4个回答

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你可以加 NEM 抑制去泛素酶（DUB）的活性，或者干脆用 denaturing IP 去拉目的蛋白，然后检测泛素化。如果真的很难做，可以试试看过表达目的蛋白，再 IP ，当然无论如何也要用 NEM 或者 denaturing IP.

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2023-05-29 10:15:42

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你可以首先参照那片文献修正自己的实验。蛋白质跟蛋白质不一样，不一定都有 ladder ，有 smear 也不错。印象中，ladder 常出现在体外泛素化反应中。另外 denaturing IP protocol 可以在 pubmed 上找到。

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2023-05-29 10:20:26

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内源性的泛素化本来就低，用MG132预处理后再提蛋白，可能好点，最好还是转一个Ub进去。

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2023-05-29 10:24:59

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还是加NEM，另外看看泛素化靶蛋白的降解时间，有些一两小时就降解完了，将要不然做不出来

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2023-05-29 10:27:45

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提问时间：	2023-05-29
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最近回答：	2023-05-29

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