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2024-03-18 11:11:56

如何提高Western样品的蛋白浓度？

最近从细胞中提了几次蛋白，考马斯亮蓝法测蛋白浓度后发现蛋白浓度都很低，想要达到电泳时上样50μg蛋白的要求就不能达到上样量最大不能超过15μl（bio-rad电泳仪）的要求，怎么办呢？求帮忙！如何将蛋白浓度提高啊？我是在六孔板里裂解的细胞，待孔内细胞长满时每孔加了100μl裂解液,是因为细胞量太少吗？那么可不可以减少每孔加的裂解液的量？还是因为裂解得不够充分应当增加裂解液的用量啊？又或者是因为裂解液有问题吗？我们是自己配的RIPA裂解液：Tris-Hcl 50mM,pH7.4，NP-40 1%，脱氧胆酸钠0.5％，Nacl 150mM，EDTA 1mM，SDS 0.1％。是没有加亮氨酸转肽酶等导致蛋白被分解的缘故吗？

蛋白质组学
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5个回答

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如果改用RIPA蛋白裂解液，蛋白浓度会提高很多，裂解的也会更充分一些


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2024-03-18 11:28:03
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将板孔中经消化的细胞收集到一起，然后进行裂解。


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2024-03-18 11:33:02
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提高细胞的数量


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2024-03-18 11:35:39
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可能要加一些蛋白酶抑制剂吧


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2024-03-18 11:37:24
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1 提高细胞浓度，不知道你的细胞大不大。正常的话6孔板可以长到10*6 ，不发生接触抑制。

2 我们做过6孔板每孔加50ul的裂解液，也可以作出来。减少裂解液的量可以提高蛋白的浓度。

3 刮细胞时，一定要充分，每个角落都要刮到。可以用专门的细胞刮刀，也可用青霉素瓶塞。要在镜下观察确认没有细胞才可。

4 我们用的是三去污蛋白裂解液，配方和你的基本一样，就是加了PMSF和酶抑制剂，这两样都是现用现加。效果还可以。


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2024-03-18 11:40:05

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提问时间： 2024-03-18
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