2020-07-01 04:02:20

WB的蛋白电泳上样前为什么要把样本在沸水中煮?

求教,WB的蛋白电泳上样前为什么要把样本在沸水中煮,另外,时间是5分钟,还是15分钟,因为我们实验室的常规是15分钟,而我看到有些是5分钟,还有,煮完后是和免疫组化中的热修复一样缓慢降温,还是迅速降温到4度,如果是迅速降温是否和免疫组化抗原修复后迅速降温所导致的后果一样,可能使蛋白发生团聚或交联,影响其抗原性部位的暴露,从而影响试验结果。先谢过各位了。


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蛋白质组学×

7个回答

只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义!二硫苏糖醇或巯基乙醇可以破坏二硫键,煮加速蛋白质的变性,SDS的存在可以使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构。100度煮10min后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾。也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳。


2020-07-01 04:28:13

是为了让菌体裂解后,有利于蛋白的变性,样品中加入SDS也是同样的目的。因为PAGE胶只能跑可溶性的蛋白,而一些较大的颗粒是不能通过交联物孔径的。至于降温我觉得没有什么标准,而且要求也没有那么严格了。我们每次都是煮完后拿出来等会后13000,离心1分钟,跑胶效果很好的。我觉得煮沸应该在10分钟更好些。一般菌体全能够裂解了。


2020-07-01 04:39:08

可能是为了让蛋白变性


2020-07-01 04:44:10

没有影响阿。我是煮完了,直接离心,然后电泳。如果不用,就4度。没考虑过是否降温快慢的问题,好像也没甚么影响阿。


2020-07-01 04:47:04

沉淀是核酸和蛋白,提取时不可能完全去除,煮沸可以变成沉淀,这样就不会在电泳时候造成条带拖尾


2020-07-01 04:49:07

让蛋白质变性,时间不是问题

2020-07-02 00:02:53

煮沸蛋白是为了让蛋白变性,蛋白质变性之后,使它的形状都变成长棒状,然后结合上sds之后,它们之间的差异仅仅变成了分子量之间的差异,而跟电荷密度没有关系,跟蛋白本身分子形状也无关。

跑电泳比的就纯粹是分子量

2020-07-09 01:06:15

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