贴壁培养的细胞提取蛋白可以消化下来后提取，也可以不消化直接提取，但是所用的裂解液的配方是不同的！我用的是后面的方法，结果挺好的。具体操作如下：首先记住一点：所有操作均在冰上进行！1）吸弃培养液， PBS洗3次；2） 加入cell lysis buffer，250ul/一小皿；3） 置摇床上要15min，注意此时是连着冰盒一起摇的，速度不要太大，以免将液体晃出；4）刮刀刮下细胞，移入EP管中；5）超声破碎，两到三次，每次2到3秒，注意将EP管置于装有冰快的小烧杯中；6）4度，12000rpm，15min ，离心；7）吸取上清至新的EP管中；8）测量蛋白浓度；9）-20度保存，所用的cell lysis buffer 的配方：Tris-cl pH 7.5 10mM （终浓度，下同），NaCl 150mM，SDS 0.1%，Triton-100 1.0%，A protein 10ng/ml，Leupeptin 2ng/ml，PmSF 1mM，我是把PmSF直接加到cell lysis buffer 里的，不是临用前加的，结果没有问题。

1.PBS洗涤培养瓶一次。2.直接加入蛋白裂解液，即刻用细胞刮刮取细胞。3.细胞在100摄氏度，煮沸10分钟。4.13500rpm，7min。5.蛋白定量。6.WB之前，每组蛋白加入10ul的上样缓冲液（4×）。7.100摄氏度蒸汽上加热蛋白1min。8.每管蛋白加入beta巯基乙醇2ul。9.13500rpm，3 min。10. 上样。

一般方法是：1. PBS洗涤完细胞后，将裂解液加入细胞中并在冰上作用十分钟，2. 用细胞刮将细胞刮下来并移至EP管冰上作用30分钟，隔一段时间轻微振荡EP管以求充分裂解3. 然后4度12000g离心15分钟。注意：尽量冰上操作。裂解液要加蛋白酶抑制剂，否则蛋白很容易降解。

我做过的是，消化下来后，离心收集细胞，没有加PBS，加细胞裂解液，超声破碎细胞大约十分钟到十五分钟左右，中间要每十秒钟后放入冰水混合物中，以防蛋白被炭化，超声完后加上样缓冲液，巯基乙醇，SDS，沸水煮5分钟。

我一般是直接加裂解液然后提蛋白，western结果还不错

我们是用pbs洗一遍，然后加裂解液，放到4℃冰箱半小时后加溴酚蓝，100℃煮5min