内参和蛋白用的抗体应该是不一样的吧，你的意思是你的目的蛋白的一抗和内参的一抗吧，可以一起孵育，两个抗体可能会有竞争，但就结果来看，影响不是很大。保险起见，可以把内参和目的蛋白位置的膜剪开，分别用相应抗体孵育，当然前提是你的目的蛋白和内参的分子量相差较多，能够明显分开。

理论上讲如果二者的一抗都是单抗的 话影响不大，但是多抗的话就难说了。还有，目的蛋白和内参的分子量是多少？？如果二者有差距的话，分开孵育比较好。

目的蛋白的一抗和内参的一抗可以一起孵育，我做过的，影响不是特别明显。当然如果能够把两者分开成两块分别孵育，最好分开。靠得比较近的话就直接一起孵育吧，混合抗体的效果也还可以，如果两个一抗都是多抗，可能会有些意外的杂带，能够区分开最好。

是可以的，这个看你内参和一抗对应的二抗是否一样，如果内参是HRP直接标记（不需要二抗），需要考虑内参信号是否足够强，不然就需要适当增加一定内参抗体（毕竟内参需要wash两轮）