2024-02-29 16:53:59

IP拉下来的蛋白上面连的其他蛋白能不能洗掉?

请教高手:用IP(免疫共沉淀)的方法拉下的蛋白上,通常都连有许多和他相互作用的其他蛋白,不知道有没有办法把这些杂蛋白洗脱下来,得到纯净的目的蛋白呢?


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5个回答

晕!不知道你怎么设计试验的,首先最大毛病在于,研究一个新的相互作用,为确定其真实性,通常会设计一个小实验,就是盐离子梯度washing的试验。一般体内天然的条件下,生理盐浓度相当于0.15M,所以在求证binding的真实性时,首先用D0.15、D0.3、(D0.4)、D0.5、(D0.6)、D0.8最高一般D1.0做一个梯度洗脱,检测在某一个浓度开始检测不到你的pro,也就是在这一盐浓度下binding会被破坏,常规越高表示结合越牢,则表示这种相互作用越可能是真实的。同时你会得到一个数据就是,在某个浓度开始出现binding大量减少,在某个浓度会彻底消失,这个数据对你未来的试验是非常非常重要的(就如同下象棋时下的闲子,看来不起眼没啥用,等到用到的时候你会发现多么重要)。因此如果你有这样一个结果,就可以选择在最大损失前的那个浓度,或者彻底消失前的那个浓度,选取原则在于,最大损失之后的那些浓度你是否能够接受,就是你能不能收到足够量的kinase;另外一个原则是越高越好,一般来说D0.3的足够了,如果你可以更高更好,D0.6或者D1.0应该没什么非特异binding的能耐受这么高的盐离子。至于Triton、DTT本来就应该在IP的buff.里面,所以这是废话。


2024-02-29 16:59:37

 IP是用来验证蛋白蛋白相互作用的,要纯化蛋白,可以用亲和纯化的方法。


2024-02-29 17:01:54

哦,不是的,其实很简单。当你做好了样品,快完成IP试验的时候,最后几步要用Washing buff.洗涤,对不?这个时候WBuf.的浓度是可变的,你可以选用一个浓度梯度进行(就是开始同时多IP几个样品,然后用不同管用不同浓度WBuf.洗涤Beads),洗涤的时候多上下颠倒1-2次,保证是不同WBuf.洗涤出来的样品,这样再用peptide或者别的elute的时候就可以保证确实是反映不同盐浓度条件下,两个蛋白相互作用的情况。这个操作最大的难度在于,开始的时候几管样品的投入量要一致,加入Beads的体积要一致,但做习惯了其实还是很简单的。这个实验可能存在的问题:就是你IP抓住的A蛋白也可能因为不同盐浓度从Beads上脱落,导致A蛋白本身呈现梯度下降,无法说明B蛋白的结合情况。但是这种现在一般出现在D0.5以上的浓度,所以可以通过曝光忽略(如果这个data你要发表的话,这其实是很好的data,专业的生化人士很喜欢的)。(我前面提过很少有蛋白能忍受D0.6,这是系统误差但属于可以忽略的部分)盐浓度是指NaCl,Buff.是含有其他离子,但是通常主要成分是NaCl。最后的问题:比如D0.3时结合量与生理差不多;D0.5时,A、B蛋白结合仅为一半;D0.6=1/4,D0.8相互作用消失,哪么这时候其实D0.3-0.6都可以选取,显然浓度越高越pure,但是问题是也许D0.5 IP下来的就不一定够你做kinase的了,这个看你自己决定;要么选择D0.3的,要么多做样品(做大量的样品)用高盐洗不计损失,后者工作量较大,但是确实更为可信。这和你文章将要发表的级别也有关系:)


2024-02-29 17:05:43

 ip拉下的蛋白都是因为蛋白间的一些相互作用被共沉淀下来的,可以加一些还原剂DTT或巯基乙醇消除S-S的作用,加一些去污剂如Triton X-100,加一些盐如NaCl,可以降低蛋白间的非特异相互作用!


2024-02-29 17:07:33

 Lysis Buff.的浓度不需要控制的,你可以用同一个浓度裂解用不同浓度WBuf.漂洗。当然如果你想用不同浓度的Lysis Buff.裂解也没错,但是对于这个试验你增加了一个难度,就是你要保证你初始的各管中cell一样,不然总蛋白都不同,哪么A蛋白也可能就成了变量。所以我提醒你在Washing的时候,多上下颠倒1-2次(或者漂洗次数增加1-2次),就是为了逼近盐浓度对Binding影响的事实。这个试验最佳的方案是初始Lysis Buff.浓度不同,但是要求太高太高了。顺便告诉你一个skill,如果你裂解的时候用高盐,再用相同WBuf.,A蛋白从Beads上非正常脱落会减少:)这个可以在你最后的目的试验中使用,等于增加了kinase的产率,但是你的预试验要差不多准确哦,不然也可能什么都没有了。


2024-02-29 18:18:33

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