2020-09-16 15:43:10

如何诱导贴壁细胞的成球?

看了一些资料及参考了一下各位的经验,但还是有些问题不是那么了然,现总结一下,望各位不吝赐教,多批评指正。关于贴壁细胞的成球实验,目前看老外都是按上面的方法直接分选干细胞放在无血清培养基、超低粘附培养皿中进行培养,但也有很多人也用细胞系做。所以请教一下如何诱导贴壁细胞的成球。问题:(1)一般选择多大的培养皿,6孔板?(2)接种密度?10000~100000个/ml还是说这个都要靠自己去摸索?有没参考密度?(3)怎么换液?A 看老外只是说一周加两次生长因子,我想那么高密度的细胞经过无血清培养肯定死一大片,这些死细胞不处理?B 也有说人说直接添加培养基,营养是在一定程度上保证了但是仍然解决不了死细胞“污染”干细胞生存环境的问题。 也有说离心换液的,如果离心的话那还得再次吹打使细胞散开。这岂不是影响成球?? 好不容易成了一点球被吹散了,又得从头再来? 纠结???D另外致密球和疏松球有什么分别,疏松球是不是假肿瘤干细胞细胞球,只是细胞的机械粘附???E一旦成球后需要消化传代,请问现在大家都用哪种酶? 有用胰酶的也有用invitrogen的asscuate的,哪种好用?


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3个回答

这是我用的肿瘤干细胞培养基配方,供大家参考,应该会对你的成球实验有所帮助:cancer stem cell media (serum free),500ml DMEM/F12+Glutamax include:

一、1%P/S (双抗),

二、1% Sodium pyruvate(丙酮酸钠)(加5g),

三、1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X) (invitrogen)(加5ml),

四、1% Insulin-Transferrin-Selenium-X Supplement(ITS) (100X)(invitrogen)(加5ml),

五、1uM dexamethasone(地塞米松)

六、200uM L-ascorbic acid 2-phosphate (sigma aldrich) (加28.954mg),

七、10mM Nicotinamide (尼克酰胺) (sigma aldrich) (加 610.6mg),

以上配好后可以在4度长期保存,每次用时的配方如下:

add fresh per 50ml media( cancer stem cell media),每50ml 上述配好的培养基,加入:

  1. 1.20ng/ml EGF(加10ul EGF(100ug/ml));

  2. 2. 10ng/ml FGF-2( 加5ul FGF-2(100ug/ml))每三天换液。



2020-09-16 15:53:42

首先不是每个细胞系都能成球的,一般来说恶性程度很高的肿瘤细胞才有可能。1、培养皿可以选择6,12,24孔板,也可以选择100 mm培养皿。2、密度需要自己摸索。低密度常用于元代肿瘤干细胞的提取,筛选可以非粘附生长的细胞。高密度用于细胞球的扩增,一般来说5000/ml以上。3、一周加两次生长因子没有问题的。细胞球生长很缓慢,培养基中的FGF和EGF至少能够支持2周以上。不推荐直接添加的,确实会影响细胞质量。细胞球传代需要用弱的消化酶,我使用的是TrypLE Express。据说Accutase和Dispase也可以。


2020-09-16 16:10:07

有的恶性程度高的细胞系是很容易成球的,但有的细胞系很困难。我用的方法是可以定期加入含生长因子的培养基,离心换液。有的细胞球很不容易吹散,有的很容易,要摸索。如果细胞球相对比较纯之后,就算打散了还是非常容易再形成的。


2020-09-16 16:12:37

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