2024-03-08 06:19:01

有谁用过可以做多聚甲醛固定的组织切片的CD31抗小鼠抗体呢?

大家好,我是新人,我在做小鼠皮下移植瘤血管内皮CD31染色,CD31是BD公司的。组织切片是多聚甲醛固定,梯度蔗糖脱水处理的,荧光染色结果是没有阳性染色。后来查看文献和抗体说明书,了解到大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体不适宜醛类固定的组织切片。文献上是将组织直接液氮速冻,再做冰冻切片,然后丙酮固定,染色。可我按照这种方法做的时候,发现组织根本无法切片,很容易破碎。现在很头痛,固定了可以切片,但无阳性染色;不固定,又无法切片。难啊!版上哪位兄弟姐妹,做个类似的实验吗?有谁用过可以做多聚甲醛固定的组织切片的CD31抗小鼠抗体呢?急死了!

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7个回答

CD31是出了名不好染啊,如果不是非要看CD31而只是要看血管的话,建议用Lectin,百试百灵,荧光,color通杀。


2024-03-08 06:20:03


(1)石蜡切片脱蜡、水化处理。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min ,100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min,95%酒精2min,80%酒精2min,70%酒精2min,过蒸馏水5min,过PBS 5min。

(2)细胞通透液处理。取配制好的TritonX-100溶液4ml,加40ul的30%H2O2,充分混合,滴加到组织片上,避光,室温通透30min。

(3)抗原修复。采用电炉水浴修复。通透结束后,PBS洗涤3次×3min,将组织片放入到水浴中进行抗原修复。此时,外层水为沸腾水,而内层修复液温度维持在85℃左右,关掉电炉,将水浴烧杯从电炉上拿下,自然冷却至室温或者自来水降温。

(4)封闭内源性过氧化物酶。修复结束后,PBS洗涤3次×3min,滴加3%H2O2—甲醇溶液于组织片上,室温,封闭20min。

(5)封闭非特异性蛋白。内源性过氧化物酶封闭结束后,PBS洗涤3次×3min,滴加正常羊血清,按1:800倍稀释,37℃封闭30min。

(6)勿洗,加一抗第八因子、CD34、CD31,按1:200倍稀释,阴性对照用PBS代替一抗。4℃冰箱过夜。

(7)第二天,37℃复温30min,PBS洗涤3次×3min。

(8)滴加二抗。按1:800稀释,37℃孵育85min。

(9)二抗孵育结束,PBS洗涤3次×3min。

(10)滴加HRP-链霉卵白素液,按1:800稀释,37℃孵育35min。

(11)结束后,PBS洗涤3次×3min。

(12)DAB显色。DAB为浓缩型试剂盒,按1:40倍稀释。显微镜下控制显色结果。

(13)自来水终止显色。

(14)脱水、透明、封片。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。注:因课题的需要,我没有进行复染。




2024-03-08 06:21:02

我用过CD31、八因子、CD34做过微血管的免疫组化。从结果来看CD31的效果最好。我的组织块是用多聚甲醛固定的,个人觉得甲醛与多聚甲醛固定差别不是很大。


2024-03-08 06:31:40

for PFA fixed mice tissue,u must use trypsin or pepsin retrievel,citrate buffer boiling does not work,for liquid-nitrogen freezed tissue,dry a little bit and fix in acetone, cut at 10 um.


2024-03-08 06:35:03

动物组织石蜡切片(即你固定后的)的CD31不好染出阳性结果,你试试冰冻组织,即切下组织用95%乙醇固定十分钟后,放4°冰箱,恢复室温10分钟后,进行免疫组化CD31染色。


2024-03-08 06:57:14

CD31是常见的血管内皮染色,耐心点。小鼠皮下移植瘤血管内皮CD31染色,CD31是BD公司的。组织切片是多聚甲醛固定,梯度蔗糖脱水处理的,荧光染色结果是没有阳性染色。这一步建议用多聚甲醛灌洗供血血管,将移植瘤内小血管中血液冲出即可,不要长时间固定;然后30%糖水脱水,组织沉下即可包埋。文献上是将组织直接液氮速冻,再做冰冻切片,然后丙酮固定,染色。可我按照这种方法做的时候,发现组织根本无法切片,很容易破碎。这一步需要将组织置入OCT中,然后再用液氮或者-80度冰箱速冻,修后再进行切片;切片后尽早丙酮固定。


2024-03-08 07:09:16

4%甲醛固定完,甲醛泡30分钟以内,CD31出的挺好,泡时间长了就不出了,我也用的BD的CD31,出的挺好,另外多聚甲醛和中性甲醛效果没什么差别。

2024-03-08 07:20:08

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