过表达质粒转染成功，为什么蛋白和RNA水平检测不到基因过表达？

最近转染遇到问题，请各位大侠帮忙分析一下。想过表达一个基因，包装病毒之前公司先给了一下质粒。大概9Kb多，带GFP。第一天铺板，第二天融合率大概60%，进行转染，4小时换液（使用lipo3000和poly plus转染试剂）。观察转染后24，48，72小时，均可看到明显的绿色荧光蛋白表达。

但是！！！！收细胞，提蛋白或RNA，做WB和QPCR，与对照组(空载体)相比，过表达组（质粒转染）都检测不到高表达，抗体没有问题，引物设计也没有问题。
既然转染成功了，为什么转录水平和翻译水平，基因没有变化呢？？？

细胞生物学

回答 0 评论

up vote 20 down vote

质粒问题

0 评论收藏举报

2024-06-26 02:00:55

up vote 20 down vote

基因重组进质粒不一定就都能好好表达这个有时无解的突变是基因大于4kb时

0 评论收藏举报

2024-06-26 02:19:34

up vote 23 down vote

质粒有没有弄错，有没有先鉴定一下质粒上是否带有你的目的片段？听你描述质粒为GFP融合表达的质粒，理论上GFP有表达目的蛋白也是有表达的，不过也存在GFP的表达影响目的蛋白表达的情况。如果真是这样的话要重新构建质粒了，要么不带GFP，要么把GFP和目的蛋白的前后顺序换一下，要么在两者之间加个linker序列，转染的同时就转染个GFP的质粒验证同批细胞的转染效率作为正对照就可以了。希望对你有帮助！

不知道你用的是什么病毒，腺病毒感染效率高，但你这应该不是。
慢病毒，逆转录病毒实验，感染细胞后，需要用药筛选，加药之后，很多情况下绝大部分细胞都死了，剩下的细胞才适合做蛋白和RNA实验。不加药筛选，就很可能看不出表达的变化。
另外，首先你得测序验证公司给你的质粒是对的。曾经遇到有同学从别的实验室要来质粒，不测序验证就直接做实验，几个月以后测序发现质粒是错的。

0 评论收藏举报

2024-06-26 02:22:54