2024-04-07 09:14:59

过表达质粒转染成功,为什么蛋白和RNA水平检测不到基因过表达?

最近转染遇到问题,请各位大侠帮忙分析一下。想过表达一个基因,包装病毒之前公司先给了一下质粒。大概9Kb多,带GFP。第一天铺板,第二天融合率大概60%,进行转染,4小时换液(使用lipo3000和poly plus转染试剂)。观察转染后24,48,72小时,均可看到明显的绿色荧光蛋白表达。 

但是!!!!收细胞,提蛋白或RNA,做WB和QPCR,与对照组(空载体)相比,过表达组(质粒转染)都检测不到高表达,抗体没有问题,引物设计也没有问题。
既然转染成功了,为什么转录水平和翻译水平,基因没有变化呢??? 

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细胞生物学×

5个回答

质粒问题 

2024-04-07 09:15:21

基因重组进质粒不一定就都能好好表达 这个有时无解的 突变是基因大于4kb时 

2024-04-07 09:34:00

质粒有没有弄错,有没有先鉴定一下质粒上是否带有你的目的片段?听你描述质粒为GFP融合表达的质粒,理论上GFP有表达目的蛋白也是有表达的,不过也存在GFP的表达影响目的蛋白表达的情况。如果真是这样的话要重新构建质粒了,要么不带GFP,要么把GFP和目的蛋白的前后顺序换一下,要么在两者之间加个linker序列,转染的同时就转染个GFP的质粒验证同批细胞的转染效率作为正对照就可以了。希望对你有帮助!

不知道你用的是什么病毒,腺病毒感染效率高,但你这应该不是。
慢病毒,逆转录病毒实验,感染细胞后,需要用药筛选,加药之后,很多情况下绝大部分细胞都死了,剩下的细胞才适合做蛋白和RNA实验。不加药筛选,就很可能看不出表达的变化。
另外,首先你得测序验证公司给你的质粒是对的。曾经遇到有同学从别的实验室要来质粒,不测序验证就直接做实验,几个月以后测序发现质粒是错的。 


2024-04-07 09:37:20

单独转染用来包装病毒的过表达质粒,是有可能不会表达这个基因。需要包装成病毒,感染细胞之后才表达。 

2024-04-07 09:39:38

建议药杀以下,转进去了可能转的很少


2024-04-10 16:11:39

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