2024-04-08 18:27:53

如何进行质粒转染?

请教哪位高手有质粒转染细胞的1.试剂2.仪器3.操作步骤,我想做这步却找不到实验步骤,多谢啦! 

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细胞生物学×

4个回答

希望这个对你有用:以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例,需要注意以下几点:1、DNA的量:Lipofectamine 2000=1:2~3。2、细胞密度大约占培养板的80%左右,转染。3、转染期间不要加抗生素,否则会导致细胞死亡。步骤如下:以24孔培养板为例:1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物,如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA(0.8g),轻轻混匀;b、Lipofectamine 2000使用前,轻轻混匀,用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000,轻轻混匀,室温孵育5分钟;c、将a+b的液体加在一起,轻轻混匀,室温孵育20分钟,使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成;3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中,轻轻前后摇匀;4、放入37度孵箱中培养24~48h后,1:10传代,加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT,找好G418对你所转细胞致死量的浓度。5、等细胞在G418作用下,长满后冻存几支(保种)。再克隆化培养:将细胞消化后计数50个细胞,加入22ml完全培养基中,混匀,分装在96孔板中(200ul/孔)。第二天在显微镜下,寻找孔中有单个细胞的孔并做标记,等做标记的孔长满后,消化、转移到4孔或6孔培养板中,最后转移到培养瓶中培养,冻存,鉴定。6、鉴定成功后,建议马上做后续实验,因为在培养过程或冻存中,转进去的基因容易从细胞中掉下来。 

2024-04-08 18:29:54

 额,我们实验室之前一直用的是lip2000,后来不怎什么时候,在冰箱里看到了一支诺唯赞的,就试了一下,转染效率很高啊,后来就一直在用了。具体的操作方法是按照他们的说明书来的,大致如下: A.细胞接种:转染前24小时左右对细胞进行转接,接种密度约为0.3~1 × 105 cells/well。过夜培养。B.ExFect® /DNA复合物包装 (该步完成后应立即转染):  在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基,并添加适量的转染试剂(2~5 μl/μg DNA, 参见表 一)。c 用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。 在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基,并添加适量的DNA (0.8~1 μg DNA/孔, 参见表一)。用 移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。 将ExFect® -培养基混合物滴加至DNA-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20 分钟后,立即转染。注意:ExFect®-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要,切勿 颠倒。 转染 注意:ExFect®在完全培养基中(基础培养基中添加血清)具有最高的转染效率,因此转染前后不需要 换成无血清培养基。 C.转染1.如特殊情况,可在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基,以防转染后孵育阶段细胞密度太大、 营养不足导致的细胞死亡。 将步骤B制备的复合物滴加至培养基中。轻轻晃动培养皿以使复合物均匀分布。 过夜培养24~48小时。 注意:如果转染后需要更换新鲜培养基,请于加入ExFect® /DNA复合物12~24小时后进行。培养基更换后,孵育24~48小时后再进行后续试验。收获细胞,进行后续实验。注意事项: 因细胞密度随细胞系不同会有很大差别,且细胞密度直接决定转染效率。因此请在转染过程中尽量 保持同样的接种比例,以提高转染重复性。多数哺乳动物细胞应在37℃、5% CO2条件下培养。其他的一些细胞系,例如昆虫细胞,需要在不 同的温度和CO2浓度下进行培养。请根据具体细胞系选择最适培养条件。应避免包装反应体系中存在血清,因血清会干扰ExFect®与DNA形成复合物。 如果转染DNA量较大或者当复合物包装时反应体系中出现沉淀,请将包装反应体系调整至1 ml进行。 

2024-04-08 18:30:52

自己搜的一些Lipofectamine 2000的材料,能指导试验步骤的,分贴壁细胞和悬浮细胞,给出来转染量度标准和优化转染指导,你可以看一看的。 

2024-04-08 18:35:48

希望这个对你有用:以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例,需要注意以下几点:1、DNA的量:Lipofectamine 2000=1:2~3。2、细胞密度大约占培养板的80%左右,转染。3、转染期间不要加抗生素,否则会导致细胞死亡。步骤如下:以24孔培养板为例:1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物,如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA(0.8g),轻轻混匀;b、Lipofectamine 2000使用前,轻轻混匀,用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000,轻轻混匀,室温孵育5分钟;c、将a+b的液体加在一起,轻轻混匀,室温孵育20分钟,使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成;3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中,轻轻前后摇匀;4、放入37度孵箱中培养24~48h后,1:10传代,加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT,找好G418对你所转细胞致死量的浓度。5、等细胞在G418作用下,长满后冻存几支(保种)。再克隆化培养:将细胞消化后计数50个细胞,加入22ml完全培养基中,混匀,分装在96孔板中(200ul/孔)。第二天在显微镜下,寻找孔中有单个细胞的孔并做标记,等做标记的孔长满后,消化、转移到4孔或6孔培养板中,最后转移到培养瓶中培养,冻存,鉴定。6、鉴定成功后,建议马上做后续实验,因为在培养过程或冻存中,转进去的基因容易从细胞中掉下来。 

2024-04-08 20:25:53

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