2019-04-17 16:11:55

能否只做磷酸化的抗体,而不做非磷酸化的抗体

打算做磷酸化抗体的WB,想请教一下,内参是选择普通的内参,如actin、GAPDH等,还是用非磷酸化的抗体。有的文献中是将磷酸化抗体的结果和非磷酸化抗体的结果的比值来i对比的。我想知道能否只做磷酸化的抗体,而不做非磷酸化的抗体(出于节省经费的原因)


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细胞生物学×

6个回答

都要做的吧 -我认为内参可以起到作为体系的对照,非磷酸化抗体的结果本身在不同的条件下可能本身就有不同,不知道我说清楚了没有,普通的内参,如actin、GAPDH等和非磷酸化的抗体都要做。普通内参保证了western操作电泳上样量一致,排除体系本身的影响。将磷酸化抗体的结果和非磷酸化抗体的结果的比值作为某种刺激(药物作用)对信号通路中某种酶磷酸化程度的影响,这种表述实验结果的方法是最客观的,也是必需的。如果不做普通内参,不能说明最后实验结果(磷酸化抗体检测目的蛋白的变化)是因上样量不同而致还是因药物(外界刺激)作用而致。如果不做非磷酸化抗体,也可能本身药物(外界刺激)作用能够导致该蛋白量和磷酸化程度都有改变,对这种双重改变表现不出来,会直接影响后续结果的分析。

2019-04-18 16:33:31

一般来说:修饰的蛋白,一定要做非修饰的蛋白,因为如果进行了处理,很有可能非修饰的蛋白量发生了变化,如果非修饰的蛋白都没有了,再做修饰的蛋白就没意义了,而且非磷酸化抗体的价格只有磷酸化抗体的价格的40%,强烈建议你买


2019-04-18 18:05:35

我觉得磷酸化水平升高与否跟其蛋白总量水平改变之间是不矛盾的,这么说吧 磷酸化只是蛋白修饰的一种形式 如果一个蛋白是通过磷酸化形式发挥功能的 那么 不管总蛋白的形式的量是升高 还是降低 该蛋白的功能形式都是增加了 所以 我认为 讨论 两者之间的比值的意义不是很大


2019-04-19 14:52:41

我觉得也可以做总的蛋白量,然后再做磷酸化蛋白的量。如总量不变,磷酸化的变了,也可以很说明问题吧


2019-04-19 16:28:25

我觉得表达量和磷酸化水平的改变 应该分别讨论 分别具有不同的意义 应该分开来讨论 表达量升高了 磷酸化水平升高本身应该不矛盾吧


2019-04-20 10:01:19

都要做,都要讨论,不能图省事,对比实验嘛

2019-05-04 13:26:00

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