NEJM综述：基因编辑治疗的起源、进展和临床试验

来源：NEJM医学前沿

2019年3月7日，《新英格兰医学杂志》（NEJM）发表了题为《一类通过DNA编辑发挥作用的新型药物》（A New Class of Medicines through DNA Editing）的综述，介绍了基因编辑的发展，讨论了将其作为治疗手段疗效、特异性、输送和安全性对于所不可或缺的作用。我们在此简介综述中的主要内容。

基因编辑的早期发展

1994年Jasin等发现，用核酸酶使靶基因中的DNA双链断裂，并且在断裂的同时提供供体DNA模板，可以提高基因编辑的效率。这一发现表明可通过同源重组在突变位点插入新序列，同时还表明可通过称为非同源末端连接（NHEJ）的过程在断裂位点产生新突变。DNA中特定的双链断裂可诱导修复这一发现，奠定了基因组编辑领域的基本原理。

已经用于基因编辑的核酸酶技术主要有归巢核酸内切酶-兆核酸酶、锌指核酸酶（ZFN）、转录活化因子样效应核酸酶（TALEN）和与Cas9核酸内切酶相关的成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR-Cas9），目前应用较为广泛的是TALEN和CRISPR-Cas9系统。

准确的切割和修复

现在大红大紫的CRISPR-Cas9系统的发现得益于科学家对细菌适应性免疫系统的研究。由于基因组编辑中仅使用细菌系统的两个成分，即Cas9核酸酶（最常用的Cas9酶来自产脓链球菌）和向导RNA（gRNA），因此称该方法为Cas9-gRNA系统更为准确。在基因组编辑中，gRNA与DNA靶位点结合后，Cas9核酸酶受诱导发生构象变化，之后将DNA切割。gRNA序列的设计简单方便，易于优化与特定DNA靶位点的杂交，从而通过DNA碱基配对将Cas9-gRNA“引导”至其靶位点。

经过核酸酶切割的DNA必须通过某种机制被细胞修复。基因编辑涉及到的修复机制为非同源末端连接（NHEJ）和同源介导的双链DNA修复（HDR）。

高效的递送系统

为了实现高效编辑，必须在不激活细胞毒性反应的情况下，将足量具有良好特异性的高活性核酸酶输送入细胞核内。对于具有完整的抵抗外源DNA和RNA的原代人细胞，必须以mRNA（进入细胞后被翻译）或核糖核蛋白复合物（例如Cas9-gRNA）的形式输送核酸酶。新型的重组腺相关病毒载体可以在向细胞核输送单链DNA时避免被细胞探测到。电穿孔是离体输送这些分子的一种有效且相对无毒的方法。

一些靶向特定通路的小分子可以增强HDR介导的细胞内编辑。但是，某些干预措施干扰了细胞的正常修复方式或应对双链断裂的方式，从而可能损害对在细胞周期中自然发生的20~40个双链断裂的修复能力。

输送核酸酶过程中的其他方面也需要考虑。例如，虽然在将核酸酶输送至原代人细胞方面，mRNA优于质粒DNA，但mRNA可诱发抗病毒Ⅰ型干扰素应答。此外，核酸酶的长期表达或低特异性核酸酶的表达可激活p53通路，从而触发细胞周期停滞和细胞凋亡。

让细胞变成药物

在所有基因组编辑方法中，目前发展最成熟的是离体基因组编辑，即在体外对细胞进行基因工程改造，然后将细胞回输到患者体内。近年，以中美两国为代表的团队已经开展了一些基因编辑的临床试验，例如：产生更强效的CAR T细胞，用于治疗癌症；敲除BCL11A的红系特异性增强子，以上调自体红系造血干细胞中的γ球蛋白，作为镰状细胞病和β-地中海贫血的潜在疗法。临床前研究提示，针对某些疾病（例如慢性肉芽肿病、X连锁重症联合免疫缺陷、X连锁高IgM综合征和HIV感染）的离体、自体、基于细胞的基因组编辑将取得较好疗效。

目前有14项已结束或进行中的ZFN试验，8项TALEN，以及12项CRISPR-Cas9。大多数有关ZFN的临床前研究已经发表并经过同行评议。

虽然体外细胞编辑已经取得了一定的疗效，但是仍然存在很多局限性，比如尚无将经过基因编辑的细胞移植到肝脏或脑的可靠方法。对于那些无法应用体外编辑治疗的疾病，体内编辑，即将编辑装置输送到患者体内从而在自然条件下对细胞进行编辑，可能发挥重要作用。

但是人体自身免疫系统对体内编辑是一个很大的障碍。所有主要核酸酶平台均包含外源蛋白。因此，长期表达核酸酶可能诱发适应性免疫应答。此外，首剂给药可能导致患者对之后的给药产生免疫力。Cas9-gRNA系统中使用的Cas9核酸酶来自两种细菌（产脓链球菌和金黄色葡萄球菌）中的一种。由于每种细菌均在人群中有普遍感染，因此大部分成人之前就对Cas9有免疫力。

棘手的安全性评估

核酸酶介导的基因组编辑会导致双链断裂，这是基因组不稳定性的一个来源，而基因组不稳定性可能导致致癌性突变。缩短核酸酶的表达持续时间（例如以核糖核蛋白复合物的形式输送Cas9-gRNA）、改变核酸酶的结合和催化活性可改善特异性。

评估基因组编辑安全性的一个关键问题是评估其准确率或脱靶率，但目前尚无经过验证的临床前检测方法。基因组内持续发生自发随机断裂，而经基因工程改造，能够改变大量细胞的核酸酶可能会促进在靶断裂和其他部位自发随机断裂之间的易位。现有检测方法的灵敏度不足以检测到这些事件的发生频率，而且也无法评估DNA断裂的功能性后果。另外，每个人的基因组在基线时就存在数百万个微小差异，这使得难以评估核酸酶产生的潜在小变化的后果，使特异性评估进一步复杂化。

虽然有不同方法（例如生物信息学、细胞捕获和体外检测）可识别哪些位点可能有脱靶插入或缺失，但每种方法均有其固有的偏差。使用动物模型预测基因工程安全性也不是预测临床试验中安全性的有效方法。所以，目前的最佳方法是在仔细控制的1期临床试验中评估基因编辑的安全性。

临床应用

单基因疾病

基因编辑目前已经能够进行高频率的基因修正，因此理论上可以应用于造血系统和免疫系统的数百种遗传病（如镰状细胞病、X连锁重症联合免疫缺陷和X连锁慢性肉芽肿病）。虽然也可通过基因组编辑对其他器官系统的单基因疾病进行基因“修复”，但仍存在分离、扩增、移植组织特异性干细胞（用于离体治疗）以及将基因组编辑工具输送到患病组织内等困难。

免疫肿瘤学

基因组编辑在临床试验中已被用于改进CAR T细胞疗法。NHEJ介导的编辑可通过敲除TCRA（编码TCRα）来去除T细胞的同种异体反应性，也可通过敲除B2M（编码β2-微球蛋白）来去除免疫原性，还可以移除抑制细胞功能的分子或者促进细胞耗竭的分子，从而增加细胞的效力。HDR介导的编辑可确保将基因插入特定基因座内。

再生医学

迄今，细胞疗法还未能利用细胞或干细胞替换或修复患病、受损或老化的组织。基因组编辑提供了改造细胞、增加细胞效力和安全性的方法，比如使细胞分泌预防神经退行性疾病的保护因子等。

合成生物学

合成生物学涉及通过基因工程改造细胞，使其获得正常情况不具有的功能。目前可以对细胞进行基因编辑，以分泌治疗性蛋白，以及利用细胞影响动物生理。将基因组编辑和合成生物学相结合的例子包括通过基因工程改造细胞，使其分泌促红细胞生成素或伤口愈合生长因子。以后还有可能通过基因工程改造细胞，使其分裂、迁移、应答、发出信号和分泌，从而对患病组织环境起到治疗作用。

技术有了，如何妥善利用？

通过采用适当的监管措施（目前并非所有的国家都有），在人体极早期发育中使用基因组编辑，可能让我们在人类胚胎发育领域获得重要且出乎意料的发现。这种研究应该得到鼓励，但我们不应允许其应用于提高人体的某项功能，例如例如使得健康人获得与治疗或预防严重疾病无关的性状。人们普遍认为，对人类基因组编辑的应用持续进行广泛而透明的讨论非常重要。

2018年11月被曝光的人类胚胎基因编辑事件，是不符合伦理、不负责任和不顾后果的，并且严重违反了关于基因组编辑应用于人体胚胎的广泛国际标准。制定可供引用的国际标准是目前的迫切需求，标准的出台有利于阻止未来可能发生的更多的鲁莽做法。

基因组编辑是一种变革性的产生药物手段。但是作为一种新兴的技术，我们还应谨慎对待。目前，应该首先考虑将其应用于严重疾病，并且在应用中关注更多细节问题。经过不断的改良和迭代，确认其安全性及有效性后，才应该考虑用于较轻微的疾病。