2020-03-02 14:48:08

有别的办法可以有效回收SDS-PAGE中的蛋白条带吗?

我的实验要用到SDS-PAGE蛋白胶回收,从别的实验室找了个蛋白胶回收的电泳曹,但电泳时电流却始终只有1mA,换了两次电泳液还是一样的结果,据分析是电泳曹不通电。请教各位还有别的办法可以很有效的回收SDS-PAGE中的蛋白条带吗?谢谢!!


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蛋白质组学×

6个回答

蛋白量比较少的话用我的方法恐怕回收率会差些!我的方法是:先跑SDS-PAGE,然后用预冷的0.25M KCl染色(预先放在4度冰箱中),目的条带会出现白色条带,根据你已经跑过的考马斯亮蓝染色的位置可以判断哪条带是你的目的条带,如果蛋白浓度高的话,染1分钟就可以看到目的条带,蛋白浓度低的话,要染时间长一些,大概5-10分钟,如果太低,估计是看不到目的条带了。无法用此方法看到目的条带。那用该方法就不行了。注意:蛋白浓度底,目的条带颜色很浅,要在背景深色的时候才能看到(可以放在透明的玻璃板上操作),因为这种染色方法灵敏度比考马斯亮蓝染色低很多。当看到目的条带时,可用一干净的刀片切下目的蛋白所在的凝胶条带,将凝胶条放在蒸馏水里浸泡,直至无色透明,目的是使得KCl离开胶条(当然目的蛋白会损失一些,但绝大多数还在胶里,因为这个自由扩散的过程不会太久),一般也就是五到十分钟就可以目测观察到胶条变成无色透明状。将无色透明的胶条从蒸馏水中取出,装入一准备好的1.5ml离心管中,用镊子夹碎(或在放入离心管之前用刀片切碎),我常用的是灭过菌的镊子夹碎。然后再在管里加入你所需要溶解蛋白的溶液,比如蒸馏水(生理盐水或PBS等)。将离心管放入4度冰箱过夜,第二天吸出管中的液体(吸之前震荡一下),至少50%蛋白可以从凝胶中析出(这要看你的凝胶和水溶液的体积比)。再加入蒸馏水抽提两次,就可以将胶条中绝大部分蛋白抽提出。我对多次抽提的蛋白经Brandford考马斯亮蓝染色法测蛋白浓度测定,证明浓度依次递减,后一次的浓度均不超过上次的50%。我所得到的蛋白浓度可达到1mg/ml。经电泳检测,只有单一条带。无任何杂带。对于后面抽提的浓度比较低的,浓缩的办法很多。也可选最简单的办法。


2020-03-02 15:03:40

普通的水平电泳槽也行。将条带装到透析膜里,条带染料跑出去以后,再80两个小时,蛋白就出来了。好像还没有类似DNA回收溶胶离心之类的试剂盒。



2020-03-02 15:07:21

你的蛋白浓度高么?要看你胶回收蛋白的目的是做什么的了,我通过胶回收蛋白,得到蛋白的量和纯度都是可观的,不需要透析袋的。


2020-03-02 15:09:58

做抗体要的就是蛋白要纯啊,一般的抗线性表位的抗体,与抗原是否变性是没关系的啦,所以可以将蛋白跑个page胶,然后用250mM的KCl染一下,大概几分钟你的目的条带就变成白色的了,然后将该条带切下,剪碎,直接加佐剂磨匀后用注射器打入老鼠皮下进行免疫。KCl对老鼠没什么大的影响,page胶里的成分对老鼠影响也不大。包含体也是可以直接免疫的。


2020-03-02 15:11:55

做免疫用,还是要纯一些的蛋白要好!用KCL染色蒸馏水抽提、切胶透析都是比较实用的办法,尤其针对对包涵体更好用!(在这样的操作环境下,可溶蛋白讲解非常厉害,其实不单单是回收率的问题,降解率要占很多一部分),我是电洗脱的,这样的办法比蒸馏水抽提要麻烦一下,但洗脱的比较干净一些,一次就可以洗脱完。如果弄的蛋白是包涵体,直接把洗脱液抽出来后高速离心就好(13000G,5-10分钟),这样几乎所有的蛋白都下来了,然后还可以用PBS把透析袋冲洗一下(少量多次),并收集冲洗液高速离心,这样就几乎不会损失什么了!最后呢,把这些包涵体都用PBS悬起来集合到一个管中,用足量PBS悬洗、离心就好了,一般洗2-3次足以!优点:胶里残留的少、透析袋里残留的少(要是浓缩就浪费好多了),注意:离心机要4°的,否则长时间操作下对蛋白不好!

2020-03-02 15:13:38

你这样做,得到的浓度不是很低吗?本来PAGE胶就点不了多少样,回收的时候反复冲洗,洗涤透析袋的液体肯定不能太少,体积很大,浓度很低。


2020-03-02 15:14:18

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