看了你叙述的过程，你在CM柱后用10kd的膜超滤想除去大于7kd的杂蛋白，结果电泳没有条带了，是吧？问题就出在你的10kd超滤上！

你可能对超滤的原理和注意事项了解的不深，10Kd的膜的含义不是说大于10kd的蛋白就全部截留，而小于10kd的蛋白就全部透出！！！特别是后一点是你试验失败的根本所在。10kd的超滤膜是指分子量为10kd的球形蛋白在固定条件下（如温度、溶液体系、粘度等等）应用超滤时截留率大于一个百分数，如95%-99%等。注意，它并没有规定小于10kd的蛋白怎样！超滤膜的孔径不是规整的定值，而是一个分布；而且也不是一个平面结构，而是一个立体的纵深结构，内有很多弯弯曲曲的通道。实际上，在应用过程当中，10kd的超滤膜对7kd的蛋白可以说能够完全截留，甚至5kd的蛋白也能截留的。我想，你应该是收集了滤出液当成目标蛋白所在，实际上，你的7kd目标蛋白在浓缩液当中。等电点在11左右的可溶蛋白纯化应该比较方便做。我想你可以试着提高一下样品的pH，再过阳离子交换柱吸附，或过阴离子交换柱穿透纯化。对你的蛋白我想提高pH到8以上应该没大问题。酵母上清表达的蛋白，色素可能是个大问题。7kd的蛋白也可以尝试用反相柱纯化试试，去除色素的效果比较好。至于盐离子，不要过于关心。超滤、透析或G25换液都能方便的解决。我给你列一个试验方案，你可以参考一下：1、离心收集酵母发酵的上清，双层滤纸过滤；2、5kd膜超滤浓缩10倍体积、换液为pH8.5的20mM PB缓冲液，换液量要比较充分，使得电导值符合离子交换柱要求。浓缩的目的是为了减少上样体积；3、串联Q和SP柱，pH8.5的20mM PB缓冲液平衡好，Q柱在前，SP柱在后。Q柱是为了吸附杂蛋白和色素，SP柱是为了吸附目标蛋白；4、上样串联柱后淋洗充分，至基线；5、分开Q和SP柱，分开洗脱两根柱，可以尝试分段洗脱SP柱方式，如0.1N、0.3N、0.5N NaCl等；6、如果纯度达不到要求，尝试反相柱，如SOURCE 30 RPC，离子交换柱样品不用脱盐，可以直接上样，采用无盐缓冲洗脱，或加异丙醇洗脱。罗嗦了一大堆，希望试验顺利！

离子交换洗脱大多是用盐梯度或盐阶段洗脱的，缓冲液中的盐可以通过过柱（如过G25或G15）或透析（低截流分子量的）等简单方法除去。所以，阳柱最好还是选择常用的缓冲液为好，多改变一下其Ph 和洗脱条件，也能除去杂质，使目的蛋白的纯度提高。你的杂蛋白主要是10kD以上的吗？由于超滤的目的蛋白是滤过的，那么会很快超滤完，所以我想超滤在离子交换前或后问题都不是太大。

1.是不是没有收到峰？2.存放的溶液环境目的蛋白不稳定？（目的蛋白对pH、温度、金属离子的稳定性？）