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2024-04-23 18:09:38

western内参不齐，为什么？

用的GAPDH，细胞时间梯度加的我杉醇，BCA法定量，结果挺好的，但是内参总是不齐。我是定量后每孔上30ug蛋白，每次都是上样前现配，蛋白离心，然后弹匀，蛋白+buffer+三蒸水，体积一致后上样。配好后煮沸5min，冰上冷却5min，离心，上样前每个样品再混匀一下。不知道是不是紫杉醇影响GAPDH表达啊？即使上样量一致每次跑出来的结果也不一样，是我的问题吗？

生物化学药理学药物化学

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4个回答

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你的第三点我没看懂，一般的提蛋白流程都是裂解，离心，取上清，bca定量，加buffer混匀煮沸五分钟，之后冻起来。上样时把样品融化，离心或者涡旋震荡，等质量上样。

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2024-04-23 18:24:40

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换个内参吧。这种情况我也遇到过。我基本上第一次跑某一批样的时候都会同时孵Actin和GapDH,哪个齐就用哪个。

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2024-04-23 18:31:56

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提取的新鲜蛋白尽快配平，煮沸变性再分装，-80℃保存。缩短样品处理与准备时间，简化操作步骤，方便加样，尽量减少蛋白降解带来的误差。

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2024-04-23 18:36:36

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“上样前每个样品再混匀一下 ”这有点儿问题，因为煮沸后底部可能会有沉淀，混匀会导致吸取蛋白的时候每次无法保证蛋白均匀和量的准确，我们是每次同样的条件下离心，然后吸取上面无沉淀的部分，这样才能保证质和量的准确。

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2024-04-23 18:37:10

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提问时间：	2024-04-23
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最近回答：	2024-04-23

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