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2024-03-29 17:36:55

构建载体，发现载体构建不成功的问题——PCR产物酶切不动，怎么解决？

本人将pCAMBIA1301载体用Fermentas的EcoRI和NcoI酶切后，能切出800bp的目的条带，也用同样的酶和buffer切PCR产物（已纯化），后连接转化，多次不成功，也是醉了。于是怀疑PCR产物没被切动，便将载体酶切后分别胶回收和纯化（纯化的含有800bp片段），以摩尔比5:1比例添加酶切后PCR产物和胶回收及纯化后的酶切载体，连接转化后载体纯化的那一份长出了很多斑（感受态没问题，检测均为空载），但胶回收的没有长斑，于是就得出PCR产物未被酶切导致实验失败的结论。但不知如何解决这一问题，请问如何解决PCR产物充分酶切？

细胞生物学免疫学

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检查下PCR片段中有没有这两个酶切位点（酶切后跑个电泳看看切后的条带有没有变化）
可以将酶切后的PCR片段送测序，看看末端是不是真的没切开

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2024-03-29 17:38:25

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酶切质粒能切开说明限制性内切酶没有问题。
一个问题，你当初切质粒的时候也是用这么多酶吗？个人认为已经是太多了，各加1 微升应该足够了。
另外一个就是，在纯化的产物上加A，然后链接T载体，再酶切，虽然烦琐点，但有时值得尝试。

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2024-03-29 17:39:21

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可以将PCR 产物连到T载体后再进行酶切。

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2024-03-29 17:39:55

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两个方向试试:

1. 尝试将载体过夜双酶切后加ap处理，去掉5末端的磷酸基团，防止自联，同时pcr产物(不过再设计引物时候要加保护碱基哦)再次酶切，然后pcr纯化即可

2. 可以尝试TA克隆。pcr产物(确保进行了加a反应)，插入t载体后，酶切出目的片段，然后与载体连接

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2024-04-01 16:12:31

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提问时间：	2024-03-29
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