2020-06-26 11:10:48

对悬浮细胞做激光共聚焦荧光扫描成像如何做粘附处理,使其贴壁?

请教高手:对悬浮细胞(淋巴细胞)做激光共聚焦荧光扫描成像如何做粘附处理,使其贴壁?


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8个回答

以前做组织免疫荧光激光共聚焦时,做过一两次悬浮细胞,所以试着回答一下你的问题吧~悬浮细胞不同于组织片,也不同于贴壁细胞,主要区别在于前者需要将悬浮细胞粘附在载玻片上,怎么样才能做到这一点呢?

1)准备好干净的载玻片,并经过用明胶或者多聚赖氨酸处理(即挂胶),如果实验室经费比较充分的话,可以去博士德公司购买已经处理好的载玻片,买来即可用于实验。

2)用移液管吸取适量的悬浮细胞液,滴在上述载玻片上,并让液体自由的铺散开来,以形成一单分子层结构,并于室温下让细胞悬浮液自由干燥。

3)用免疫荧光专用的画笔在干燥的液面边缘划圈,以免后续的操作时液体流失。

4)滴加适量的4%多聚甲醛缓冲液,室温固定30分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟。

5)0.4%Triton-X100室温消化处理30分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟。

6)3%BSA封闭,37度,30分钟。

7)轻轻甩去封闭液,勿洗,滴加一抗,4度孵育过夜。

8)PBS冲洗3次,每次5分钟。

9)滴加荧光二抗(以下均需避光操作),37度孵育30分钟(切记勿干)。

10)PBS冲洗3次,每次5分钟。

11)隔着液相在荧光显微镜下观察染色结果,如果片子比较干净,没有残留的杂质颗粒和荧光颗粒,随即用中性树胶封片。

12)激光共聚焦显微镜下观察染色结果。然后用专用的图像处理软件对不同激发波长下的染色图片进行叠加处理,即可得到你所要的共存图像。


2020-06-26 11:20:57


步骤也就是常规的固定,1抗,2抗,孵育抗体也就是固定后直接加进去就可以了。主要是中间洗的时候要一直用离培养板的离心机来离心做,和悬浮细胞做MTT比较类似。CONFOCAL对细胞厚度和层次要求不高,平底的铺吸附介质培养板的培养板在抗体孵育完成后就可以离心后直接拍摄了,当然,定位可能会不如正常的爬片细胞好看。还有种方法是把细胞吸到EP管里用普通离心机离心来孵育和洗涤,方法和细胞换液时候吹打比较类似,最后可以把细胞吸出来滴到盖玻片上封固,这样的好处是几乎是单层,拍摄效果好,荧光显微镜也有好结果。
我们组做的悬浮细胞荧光并不多,传一个T淋巴细胞的TUBULIN染色,这个就是CONFOCAL直接拍摄的6孔板底部的图片。

图片2.png



2020-06-26 11:43:02

一般来说,封片分为临时封片和永久性封片,所谓临时封片,就是用水溶性的封片剂,比如缓冲甘油(30%)滴在载玻片上,随后用盖玻片平整盖上。这种封片方法的好处是:如果觉得没封好,随时可以将盖玻片撬开,用PBS冲洗后,重新封片,尽管如此,还是要注意一点诀窍,即宜先在盖玻片表面滴加PBS,一会后即可见盖玻片自然漂浮起来,然后用镊子一角温柔的夹开盖玻片,切忌强行直入撬盖玻片,否则到时悔之晚矣。临时封片的缺点是:片子染色看上去没什么光泽,有时还会出现水雾样,据说时间久了片子还会发霉,重要的是染色背景不能很好的褪除,原因是水溶性封片剂是不容易去除背景而增加片子染色光泽滴,即所谓的相似相容。所谓永久性封片,即片子一旦封上了,就不能重新撬开再封了,这种封片采用的封片剂是中性树胶,粘性很强,且含有二甲苯,能够褪去片子中的一些背景染色,并且能够增加片子的光泽感,所以用这种封片剂封的片子很干净,色泽很好。不管采用那种方法,切记:封片剂一丁点即可,加多了反而会使封片剂外溢,导致看片时粘到到处,特别是镜头,一般来说,封片剂滴加在目的区域上。同时切忌:盖玻片盖上后让其自然的放一会,封片剂自然后铺散开来,不要用镊子压盖玻片,否则,再好组织形态的片子最后镜检时都会像爬山虎,呵呵~


2020-06-26 11:59:52

可以尝试做Cytospin,我们组的做的pDC,也是用的confocol,效果不错

2020-06-26 12:00:16

关于封片,我多说两句,真敢拿中性树胶封带水的片子,不管是组织还是细胞,必然结果是含水多浆糊,含水少模糊。中性树胶是用二甲苯溶解的,二甲苯在水的溶解度极低,这就是为什么组织的片子封片之前要梯度酒精脱水,并且脱水不完全会导致树胶封片后部分视野模糊。荧光的片子特别是细胞的免疫荧光,是不需要脱水的,因此按照楼上的步骤,PBS洗完就中性树胶,浆糊是难免的,即使风干,细胞内或组织的水分是无法完全去除的。何况想不通的是,荧光激发后逐渐猝灭,数次观察后并没有长期保存的必要,另外,现在粘附性的荧光封片剂产品多多且便宜,这年头,再用甘油封片就有点OUT了。贴壁细胞可以做爬片也可以在平底板中直接倒置拍摄,关于悬浮细胞,如果是confocal,完全可以抗体孵育完毕后离心6孔板后直接拍摄,除非是难做的蛋白,否则没有什么处理的必要。


2020-06-26 12:09:09

我手头的激光共聚焦显微镜是倒置显微镜。用户的样品是悬浮细胞时,直接用加样器抽20微升细胞悬液,在长条盖玻片上点上一个小液滴。悬浮的细胞会漂动,没法看。放到镜下等一两分钟。细胞就沉到玻片表面停下来了,赶紧观察拍摄。过了十来分钟,液体干了就啥也没法看了。


2020-06-26 12:14:04

直接将中性树胶滴在贴在载玻片的细胞上,然后轻轻的将盖玻片盖上。整个过程还是有很多细节要注意的:1)片子处理完后,最好让它自然干燥后再开始封片,否则残留的水份或者PBS会影响封片后片子的色泽。2)中性树胶不宜太稠,否则到时滴在片子上后不易铺散开来。所以最好是买新鲜的中性树胶,好像不贵的,用后瓶盖盖严,并用避光纸(锡箔纸)外包,避光保存。3)中性树胶不宜滴加太多,一小滴即可。由于中性树胶粘性很好,所以不要用移液器或者吸管滴加,用黄色的tip头(记得要将tip头尖剪平)稍微一蘸,大概还不成滴的那种量吧,最好滴在你要观察的目的区域,但是对于细胞悬浮液样品之类的,就没有明确的目的区域了。中性树胶滴上后,要随即将盖片盖上(切记盖片要很干净哦,否则到时会前功尽弃的),否则中性树胶中的二甲苯很容易挥发,一会就变得很干稠了。4)最后,再次提醒,盖片盖上后,千万不要用镊子等去压盖片,否则后果不堪设想,在盖片的重力下,中性树胶会慢慢的均匀的沿组织片周围铺散开来的,心急吃不了热豆腐~呵呵,膜蛋白消化液我是前段时间看到有一篇比较高的文章的方法学里用过,用膜蛋白消化液处理后的样品再去做WB,就没有目的蛋白条带了,其目的是为了证明这种蛋白是膜蛋白而非胞浆或者核蛋白。延伸开来,如果组织片经过膜蛋白消化液消化处理(相当于原位杂交中的胃蛋白酶K),在荧光显微镜下观察,原本应该在膜上表达的蛋白肯定是没有荧光出现了。遗憾的是,当时没有记下该文献,所以一时也查找不到具体的方法。待我找到了,再详细的告诉你吧,一点愚见,仅供参考!


2020-06-26 12:15:38

一般来讲,倒置显微镜都是反着放的,正置显微镜都是正着放的。为什么这样?是根据显微镜物镜镜头要求的,高级镜头(尤其是高级高级高倍镜头)一般都有一个数字比如0.17mm,这就要求组织和镜头之间的距离是0.17mm,怎么样才能达到这个距离呢。我们一般的盖玻片的厚度就是0.17mm的厚度。所以倒置显微镜,如果你正着放,组织和镜头之间的距离就是载玻片的厚度,这个厚度要远远大于0.17mm的,因此要倒着放。普通的显微镜一般都是正置显微镜,所以组织是正着放,也是为了保证组织和镜头之间的距离达到镜头的要求。

2020-06-26 12:17:52

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