我做重叠延伸PCR已将近5个月了，我的目的是连接两个基因片段，最后进行表达。3月份时开始做的，当时用一般的Taq酶扩的，从克隆一直做到最后的表达都挺顺的，但后来测序发现有比较多的突变的情况。于是后来考虑用高保真的酶扩，用的是Pyrobest，扩增也能得到融合的基因，也克隆成功过一次，但测序发现设计的linker缺失了一个碱基，由此会造成读码框的移码而影响表达，所以后来一直处于质粒的重新构建中，但是直到现在无论是加A连T还是直接酶切后连表达载体都不成功，也送过几次PCR产物测序，都存在linker缺失1bp的情况，但这时测序的缺失和以前测序的缺失不在同一个位置。现在比较混乱，不知道问题到底出在哪儿？？？
我的PCR是分两次做的，第一次分别扩增两个片段，然后以扩增后的PCR产物为模板来扩增融合基因，开始时的PCR产物进行了回收能扩到融合基因，后来不回收直接扩，也能扩到融合基因。不知道是不是我的操作的问题？
另外我扩增时除了能扩增到融合基因外，还会有杂带，但这个我并没有在意。拖带的情况有时也会比较严重，但这些都不是我现在最在乎的问题，我现在最关心的是用高保真酶扩了怎么还会出现linker缺失1bp的情况？