2021-11-11 20:34:03

只检测到了总AKT,没有检测到磷酸化AKT,说明什么问题?

我做的细胞实验,想要探讨某个因子影响细胞凋亡的作用途径,现在做Western的结果是检测到了某时间点的总的AKT,各组表达相当,但是没有检测到磷酸化的AKT,另外其上游的PI3K也没有检测到,这种情况可能吗?说明什么问题呢?请教高手指点迷津啊 

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凋亡坏死与自噬×

9个回答

磷酸化的AKT一定要加磷酸酶抑制剂,如氟化钠,矾酸纳.本人用的是矾酸钠.但是我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.
原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:100mM原矾酸钠激活储存液配制:(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄),(2).煮至无色
(3).室温冷却(4).重调PH至10,(5)重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色,并且PH稳定于10,分装100ul/管,每10ml裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保存.本人就是这样做出来的,以前没有加磷酸酶抑制剂,一直都没有做出来,
另外,裂解细胞一定要在冰上操作,裂解液加入后稍微晃动一下迅速把细胞刮下来,动作要快.其他的步骤没有特殊的.
希望对你有用.希望大家多多交流. 

2021-11-11 20:34:37

如果不是抗体的问题,应该是你检测的信号通路没有被激活 

2021-11-11 20:36:42

 为了确定你怀疑的问题,建议你先用EGF或insulin刺激一下所培养的细胞,而后再western 一下p-Akt,如果还没有条带,就是细胞来源的问题或是取样的时间段差的太多。另外,关于总的PI3k的检测不知你用的什么样的抗体,一般是用anti-P85亚基的来检测,而关于活化的PI3k是不能单纯的用anti P-PI3k来检测的,这个涉及PI3k对下游PIP等的活化,需要用免疫沉淀等,请阅读相关文献。 

2021-11-11 20:37:53

基本上是这样的。 但相同剂量下,EGF的促进作用估计要比你的试剂强,如果EGF激活了上述通路,你可以加大你的因子的浓度,如果还不行的话,基本就是因之本身对此通路无作用。 

2021-11-11 20:39:33

对于这个问题,你可以做以下事情:1 首先,用阳性对照检测p-akt的抗体是否有效;2 其次,你可以用PI3K/akt通路的抑制剂阻断该通路,是否可以阻断你所用试剂的抗凋亡作用;3 你也可以检测一下akt的下游底物的变化情况;最后,PI3K的活性不是由WB来检测的。希望你的问题能早日解决 

2021-11-11 20:41:53

检测磷酸化AKT使用的抗体只会与磷酸化位点结合,也就是说,磷酸化位点必须存在,但是我听说,需要使用抑制去磷酸化的药物,如正矾酸钠等才能抑制去磷酸化.而我们检测总的磷酸化AKT时使用的抗体不是针对磷酸化位点的,因此,我想这是不是这两者的区别,我也在做AKT,在没有添加抑制去磷酸化的药物时没有检测到磷酸化的AKT.不过没有检测过总的AKT,希望多多交流. 

2021-11-11 20:46:22

在准备LYSATE时一定要加磷酸酶抑制剂,否则你检测不到磷酸化的AKT,因为都被水解了. 

2021-11-11 20:54:00

 要加!NAF(ser/thr磷酸酶抑制剂)和钒酸钠(tyr磷酸酶抑制剂)各2mM.国产正钒酸钠也行。 

2021-11-11 20:55:49

不太熟悉你研究的这条通路,但WB做出总AKT表达,而没有检测到p-AKT表达,那可能有几方面的问题:1、如上面各位所言,本身通路没有被激活,你可以通过查阅文献和尝试试验去继续验证!2、提的蛋白有问题,没有加磷酸水解酶抑制剂,我也在做的TGF-bata通路涉及Smad2/3及p-Smad4的检测,我们的蛋白裂解液就加了磷酸水解酶抑制剂。刚开始做,但预试验Western Blotting已经做出p-Smad4,所以你没有用磷酸水解酶抑制剂可能是一个原因。我们实验室用的是:RIPA+PMSF+cocktail。可以一试!3、一抗的浓度问题:我们预试验p-Smad4时发现我们做出来所需一抗浓度几乎是公司推荐浓度的5倍,我们用的是Cell signal的抗体,他们推荐用1:1000稀释,我们用到1:200才做出来,而一般的Smad2/3按照他们推荐的1:1000即可以得到满意的结果。是不是磷酸化的抗体浓度都要加大?可以加大一抗浓度看一下。以上纯粹个人体会!仅供楼住参考! 

2021-11-11 20:56:15

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