磷酸化的AKT一定要加磷酸酶抑制剂,如氟化钠,矾酸纳.本人用的是矾酸钠.但是我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.
原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:100mM原矾酸钠激活储存液配制：(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)，(2).煮至无色
(3).室温冷却(4).重调PH至10，(5)重复（１）（２）（３）（４）直至溶液保持无色，并且ＰＨ稳定于10,分装100ul/管,每10ml裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保存.本人就是这样做出来的,以前没有加磷酸酶抑制剂,一直都没有做出来,
另外,裂解细胞一定要在冰上操作,裂解液加入后稍微晃动一下迅速把细胞刮下来,动作要快.其他的步骤没有特殊的.
希望对你有用.希望大家多多交流. 

如果不是抗体的问题，应该是你检测的信号通路没有被激活 

 为了确定你怀疑的问题，建议你先用EGF或insulin刺激一下所培养的细胞，而后再western 一下p-Akt,如果还没有条带，就是细胞来源的问题或是取样的时间段差的太多。另外，关于总的PI3k的检测不知你用的什么样的抗体，一般是用anti-P85亚基的来检测，而关于活化的PI3k是不能单纯的用anti P-PI3k来检测的，这个涉及PI3k对下游PIP等的活化，需要用免疫沉淀等，请阅读相关文献。 

基本上是这样的。 但相同剂量下，EGF的促进作用估计要比你的试剂强，如果EGF激活了上述通路，你可以加大你的因子的浓度，如果还不行的话，基本就是因之本身对此通路无作用。 

对于这个问题，你可以做以下事情：1 首先，用阳性对照检测p-akt的抗体是否有效；2 其次，你可以用PI3K/akt通路的抑制剂阻断该通路，是否可以阻断你所用试剂的抗凋亡作用；3 你也可以检测一下akt的下游底物的变化情况；最后，PI3K的活性不是由WB来检测的。希望你的问题能早日解决 

检测磷酸化AKT使用的抗体只会与磷酸化位点结合,也就是说,磷酸化位点必须存在,但是我听说,需要使用抑制去磷酸化的药物,如正矾酸钠等才能抑制去磷酸化.而我们检测总的磷酸化AKT时使用的抗体不是针对磷酸化位点的,因此,我想这是不是这两者的区别,我也在做AKT,在没有添加抑制去磷酸化的药物时没有检测到磷酸化的ＡKT.不过没有检测过总的AKT,希望多多交流. 

在准备LYSATE时一定要加磷酸酶抑制剂,否则你检测不到磷酸化的AKT,因为都被水解了. 

 要加！NAF（ser/thr磷酸酶抑制剂）和钒酸钠（tyr磷酸酶抑制剂）各2mM.国产正钒酸钠也行。 

不太熟悉你研究的这条通路，但WB做出总AKT表达，而没有检测到p-AKT表达，那可能有几方面的问题：1、如上面各位所言，本身通路没有被激活，你可以通过查阅文献和尝试试验去继续验证！2、提的蛋白有问题，没有加磷酸水解酶抑制剂，我也在做的TGF-bata通路涉及Smad2/3及p-Smad4的检测，我们的蛋白裂解液就加了磷酸水解酶抑制剂。刚开始做，但预试验Western Blotting已经做出p-Smad4，所以你没有用磷酸水解酶抑制剂可能是一个原因。我们实验室用的是：RIPA+PMSF+cocktail。可以一试！3、一抗的浓度问题：我们预试验p-Smad4时发现我们做出来所需一抗浓度几乎是公司推荐浓度的5倍，我们用的是Cell signal的抗体，他们推荐用1：1000稀释，我们用到1：200才做出来，而一般的Smad2/3按照他们推荐的1：1000即可以得到满意的结果。是不是磷酸化的抗体浓度都要加大？可以加大一抗浓度看一下。以上纯粹个人体会！仅供楼住参考!