CST的抗体用的多去了，总体来说akt的抗体还行，pakt用过两个效果不是特别好，蛋白提取的时候没有加其它的磷酸酶抑制剂？一抗与二抗稀释的时候用5% BSA-TBST，一抗1:500是不是有点高了？怎么没有试试1:1000？1:2000？
另外二抗稀释度需要调整，可以减低背景
ECL用那个公司的？

1）裂解RIPA中加入磷酸化酶抑制剂；
2）CST的p-AKT刚好用过，建议用1：1000，二抗1：5000；
3）裂解时每15分钟混匀一次，裂解1h；
4）注意发光液有无过期；
5）我的经验是，上样30-50g蛋白时，曝光时间p-AKT需要15分钟（参照Actin 3秒钟）；

6）可考虑根据说明书取阳性对照样本上样，我们是用小鼠肝癌组织蛋白。

最好是按照CST的protocol来做，比如封闭用5%牛奶（而非5%BSA,尤其是对pAKT 而言，效果更好）in TBST 室温一个小时，一抗稀释在5%BSA in TBST 中（而非5%脱脂牛奶）4度过夜，这样我相信背景会降低，提高信噪比。

理论上, 用WB测蛋白的磷酸化的时候,常规是BSA比牛奶更好. 因为牛奶中含有casein, 会非特异性的和测磷酸化的抗体结合,导致背景着色提高.AKT的磷酸化,我自己也用过BSA 也用过脱脂奶粉.感觉没多大区别.
磷酸化如果测不出来的时候
1. 可能是这个组织或细胞本身的磷酸化很低. 但是你用的那几个脏器,比如肝肺 都能测出来的.像前面几位战友说的那样,可以考虑加大上样量
2. 是否WB的条件不好? 可以跑其他蛋白的WB看看,如果其他蛋白质都跑出来的很好的话, 可以考虑换个抗体试一试,,但是话说回来,cell signaling的p-AKT 很好的,我也用了好几年.ser473和T308都不错的.
3. 条带弱的话,可以用 can get sinal 去提高抗体的敏感度.
BTW, 我自己跑p-akt的时候, 1抗是1:1500 2抗是 1:20000