cross-linked 然后跑胶分别用三个抗体作WB。

 做co-IP?

酵母双杂交应该可以验证 A/B B/C 的结合。如果构建三个质粒，融合的A ，融合的 C，单独的 B。A 和 C其中 一个binding, 一个activating。也许可以检测到。

co-ip是很简捷的方法，可以算初步证明。two-hybrid是分子生物学上的证明。Cross-linking是化学证明。cross-linking就是水溶性用缩合剂（EDC）将非共价键结合的复合体用化学键连起来, 在变性胶下不会离解。由于复合体是in close proximity，在低浓度的edc状态下，复合体的亚基间发生化学偶联的机会比游离的蛋白高。偶联后，会产生一个大的不可离解的复合体。当初发现核糖体就是这么发现的。采用蛋白晶片和抗体晶片也行，原理与co-ip相同。跑非变性胶，复合体也有可能离解。用gel-filtration （Sephadex,Spephacryl)也行，但样品量要求很大。

共沉淀的问题在于只能用A去沉淀检测C或者c去沉淀检测A，其他的因为AB BC均不说明问题，这样最多说明AC可能在一起，还是没有提供ABC在一起的直接证据。cross-linking我还是没懂，就是说只有蛋白已经结合在一起了，linking上以后结合牢固了，这样可以跑胶用抗体检测了，而本来不在一起的蛋白不会连上，这样理解？

cross-linking的理解是对的，但反应浓度和时间很讲究。否则会发生与非complexed蛋白偶联。edc的作用机理是： 先与蛋白的羧基（COOH)脱水形成活性中间体， 然后与氨基反应成稳定的脒键(amide bond)。这个活性中间体能迅速降解， 所以已经形成complex的蛋白被相互连接的可能性大大于与非complex的蛋白。所以控制反应浓度，时间很重要。共沉淀的理解不对。比如：你用抗A的抗体作IP, IP下来的complex跑胶分别用抗A,抗B,抗C的抗体WB检测， 如果3个抗体都出现信号，那么初步认为是ABC是复合体。如过出现了A,C而无B信号，是A-C复合体，如过出现A,Ber无C信号，是A-B复合体。如果出现B,C无A信号，无效。你可以用任何一个或A或B或C的抗体作为IP抗体。 只要是Complex， 用哪一个抗体IP，结果一样。问题在于那一个抗体能IP。 complexed蛋白的epitope也许会被覆盖，就IP不成了。

应该说明可能存在AC，AB，ABC三种复合体吧。如果你是要证明A、C是通过B形成复合体，那可能需要缺失突变B吧。