2020-06-25 20:56:33

如何解决免疫共沉淀的重轻链问题?

我现在要做免疫共沉淀了,可有个问题搞不明白了。我手里的两个蛋白抗体都是兔源的,就是说用他们两个做IP和western肯定会涉及到显影后的重轻链条带。可恨的是我的两个蛋白分子量一个25KD,另外一个52kd 左右,那怎么才能去除重轻链的影响呢?要是跑非还原胶重轻链应该多大分子量呢?那怎么处理IP后的样本,保证我的蛋白分开,重轻链有不解聚呢?可能么?谢谢!


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3个回答

如果跑非还原SDS胶的话,igG的分子量应该是150KD,但是你还有两个蛋白呢,它们有多少二硫键呢?而且涉及IP和WB所用抗体的特异性问题,更说不清楚。要去除重链轻链的影响,解决的方法还是有的:

1.用兔的igG做对照

2.用抗Fab和Fc抗体特异性封闭轻链和重链

3.在WB二抗上下工夫,这种二抗针对的是轻重链间的二硫键,所以如果跑SDS胶,最后显影是检测不到轻链和重链的

2020-06-25 22:03:52

你做WB的时候,对照设得好一点,争取出一个比较权威的结果。例如你可以在的IP后的样品里一个加入一抗和二抗,另一个只加入二抗,两者差异的条带,即为你的目的条带。


2020-06-25 22:12:32

你的这个问题困扰了不少人,轻重链对目的蛋白的影响,如果你用Protein A 或G来做沉淀用的二抗,WB还会有Protein A或 G造成的杂带的影响。楼上的建议的几种方法理论上可行,但是实际操作起来难度和消耗都较大,第一,你需要购买几种特殊的抗体来做封闭用,封闭的效果,很难预测。第二,WB用特异的二抗,这个市场上不一定有卖,即使有也一定价格不菲。第三,假如这些条件你都具备了,你要对这个实验进行很好的条件优化,要想得到一个好的结果,我认为没有十次、八次的WB是作不出来的。以前我也遇到你这个同样的问题,后来是买个试剂盒搞定的。


2020-06-25 22:15:21

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