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2024-04-28 01:04:15
Western Blot无目的条带（大分子）整张膜都很白，为什么？我的目的蛋白是BRCA1，预测分子量220KD，说明书上的样图实际分子量在250KD以上（换了三次抗体，三支抗体说明书都是这样标注的）。全蛋白裂解、核蛋白裂解、胞浆蛋白裂解都试过；8%、10%、12.5%的分离胶都用过；湿转300mA 220min、40V 12h都转过；封闭时间1h、2h都试过；一抗4度孵育12h、24h、48h、72h都试过，一抗浓度比1:100-1000也都试过，并换过三支抗体；二抗换过两种；发光液普通和超敏的也都试过，但都是白膜，偶尔能在发光时看到泳道的痕迹，但是没有条带。阳性对照蛋白也用过，仍旧没有目的条带，内参出的都不错，所以认为不是样品蛋白的问题。换过3次抗体都无果，个人认为也不应该是抗体质量的问题。 |
4个回答
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膜上面如果有蛋白转过去的话，在转膜完成后，刚揭下膜的时候，你顺着光以一定角度看是能够看到蛋白条带的。你可以试试，至少知道问题出在转染前还是转染后。你要实在看不到蛋白条带也可以试下蛋白染色，有个aminoblue还是啥的可以直接染转到pvdf膜上的蛋白的，这样至少能知道，膜上面究竟有没有蛋白。我之前是能在看到蛋白条带，但是就是显色曝光看不到条带。 |
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我之前做的是小分子，也有出现过白膜的情况，也是调试过很多参数，最后发现是我那管一抗用太久导致的，我其实也觉得奇怪，那管一抗价效很高的，我也不常用，按理说不会一下子就没效了。总之，我之后新配了一抗，加了足够的叠氮钠，貌似就没再出现过这个问题了。 |
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我做mTOR，分子量285k，转膜用湿转，biorad的仪器，200mA转120min，染色条带清晰。建议:1:提高蛋白上样量；2:摸索转膜条件，别转过了；3:换家公司的抗体，比如CST或RD这种比较稳当的公司的抗体。 |
