2020-07-09 03:52:26

Western Blot无目的条带(大分子)整张膜都很白,为什么?

我的目的蛋白是BRCA1,预测分子量220KD,说明书上的样图实际分子量在250KD以上(换了三次抗体,三支抗体说明书都是这样标注的)。全蛋白裂解、核蛋白裂解、胞浆蛋白裂解都试过;8%、10%、12.5%的分离胶都用过;湿转300mA 220min、40V 12h都转过;封闭时间1h、2h都试过;一抗4度孵育12h、24h、48h、72h都试过,一抗浓度比1:100-1000也都试过,并换过三支抗体;二抗换过两种;发光液普通和超敏的也都试过,但都是白膜,偶尔能在发光时看到泳道的痕迹,但是没有条带。阳性对照蛋白也用过,仍旧没有目的条带,内参出的都不错,所以认为不是样品蛋白的问题。换过3次抗体都无果,个人认为也不应该是抗体质量的问题。


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4个回答

膜上面如果有蛋白转过去的话,在转膜完成后,刚揭下膜的时候,你顺着光以一定角度看是能够看到蛋白条带的。你可以试试,至少知道问题出在转染前还是转染后。你要实在看不到蛋白条带也可以试下蛋白染色,有个aminoblue还是啥的可以直接染转到pvdf膜上的蛋白的,这样至少能知道,膜上面究竟有没有蛋白。我之前是能在看到蛋白条带,但是就是显色曝光看不到条带。


2020-07-09 03:57:01

我之前做的是小分子,也有出现过白膜的情况,也是调试过很多参数,最后发现是我那管一抗用太久导致的,我其实也觉得奇怪,那管一抗价效很高的,我也不常用,按理说不会一下子就没效了。总之,我之后新配了一抗,加了足够的叠氮钠,貌似就没再出现过这个问题了。


2020-07-09 04:01:45

我做mTOR,分子量285k,转膜用湿转,biorad的仪器,200mA转120min,染色条带清晰。建议:1:提高蛋白上样量;2:摸索转膜条件,别转过了;3:换家公司的抗体,比如CST或RD这种比较稳当的公司的抗体。


2020-07-09 04:05:02

带上抗体说明书上的细胞裂解液做阳性对照,看看有没有条带,如果还是没有,向公司申请退货。另外,check brca在你的细胞中表达情况以及突变情况,看看是不是本身你的细胞的这个基因就不是正常的。


2020-07-09 04:05:49

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