(1)超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放) 策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。 (2)样品或者是结合缓冲液不正确: 策略:检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份(EDTA等)。确保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及起始咪唑的浓度不是太高。 · (3)组氨酸的标签没有完全的暴露 策略:在变性条件下(用8M脲,6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT 进行纯化。 (4)His标签丢失,策略1:WB或者anti-his的抗体检查His是否表达,上游构建,改变his-tag的位(C-terminal or N-terminal),必要时增加his个数(常用6-10个)。策略2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间。策略3:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。 Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子,也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。可以利用Hitrap IMACHP来筛选不同的金属离子,具体应用实例请参考《Recombinant Protein Purification Handbook》。
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