2020-05-18 17:21:20

抗体中碱性峰的去除效果很不好

抗体中碱性峰的去除,现在发酵碱性峰含量高,占到近20%,要求占到12%,利用盐与pH梯度梯度试过,可是去除效果很不好,不知各位有什么好的去除方法没?谢谢!

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4个回答

 如果只是从纯化角度去考虑,我知道的有两个方向,第一个简单点,因为在CEX中碱性组分后洗脱,所以可以产取分段收集的方式。碱性组分后洗脱,把最后部分洗脱下来的样品舍弃(碱性主要为主),可保证整体的碱性组分含量符合要求。第二种,摸索纯化工艺,更换介质。有一篇文献,

High-Throughput Chromatography screening for modulating charge related isoform patterns

其谈到的就是利用DOE实验筛选介质和最后洗脱的盐溶度以及pH,盐浓度低时,结合能力较强的碱性组分不会被洗脱下来。 但这两种方法,均会牺牲部分的回收率。 碱性组分很复杂,在HPLC-IEC中定量有时不准,很多含量很小的峰不能表征出来。。。不知道你确定碱性组分含量是怎么定量的?

2020-05-18 19:46:42

生物类似物就不说了,尽可能一致。

而对于新药,趋势应该是越来越严,研究得越发透彻。 我了解到的行程貌似这样。

1、最初,类似于ERBITUX,它的CEX图是非常经典,不下十个峰,且比例都很接近,也没有对其每个峰进行鉴定,只要其免疫原性、活性等均无影响,就这么上市。

2、几年前,报了一个新药,也没做此类研究,最终也拿到了批件,但后续CDE的专家还是要求企业去分离,鉴定。 因而我们在做其他类似物、新药的时候,有时间都会去做做一做,至少打个PTM,看看关键的翻译后修饰情况。以免被提出质疑。

目前大家都在做新药,QBD的理念,在分子设计时可能已经把一些容易发生PTM的位点规避了,那么再与CDE老师交流时可以解释一部分。但是蛋白实在复杂,一做CIEF或CEX可能又是一推峰。

我觉得首先是看关键的PTM,如免疫原性的东西,聚体、NGNA含量、α1,3-Gal有无等等,如果有个酸碱峰中有这些东西,必然得好好研究且设定限值。然后关注比例高的峰且与主峰差异大的峰(保留时间相差大),做不到每个峰都细致研究,能对一些重大差异的峰做个定性。如K峰,差异大,但做个酶切即可说明。  最后关注下活性或半衰期相关的以及稳定性实验中变化的峰,比如一般酸性峰中主要是脱酰胺引起,且影响活性,设定限值。稳定性实验中变化大的峰应该要加以说明是何种原因引起。

个人拙见。

2020-05-18 20:00:36

美国的USP拟收录的几个抗体 Bevacizumab、Rituximab和Trastuzumab抗体中关于Cation Exchange Chromatography 都标注的是(after carboxypeptidase treatment),在方法学验证报告中有详细的描述,可以参考下。我想知道我们国内企业一般是如何定这个标准的,是两个都做还是不用CPB处理的。



2020-05-18 22:17:29

降低一点碱性区的含量,纯化是可以做到的,这需要牺牲一点收率,并对工艺条件严格控制。但是我也不推荐你用纯化,很明显细胞培养的工艺不稳定,即使你们现在可以解决,难保放大到更大规模不会出现新的问题。


2020-05-18 22:55:33

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