我也做过心肌组织的蛋白，没灌流，就用PBS冲洗了下，上清液也有黄红色出现，BCA定量很齐，你的不齐会不会是loading的体积没有加上或蛋白降解也有可能的，最好免疫印迹前定量，转膜或显影不齐后有没有适当自己调整上样量，有时我定量后也不太齐就自己调整下体积。再就是你蛋白检测的方法是哪种，ECL孵育完全与否及X胶片压片的时间长短也会直接影响条带的粗细的。

1、个人认为最好还是灌流，虽然做的是缺血缺氧模型，但在取材的时候应该来说这个模型是已经做成了的，或者说已经有改变了的，灌流不是完整的灌流固定的操作，只需要用20-50ml生理盐水迅速地把血冲出来即可，过程很快；

2、含血的组织进行BCA定量，应该来说是会受影响，一是因为里面有血红蛋白，也是一种蛋白；二来血红蛋白还有颜色，而无论哪种方法测定浓度的时候都是靠吸光度来测定OD值的，可能因为是所有的样品都含有血，所以在定量的时候这种差别被隐藏掉了；

3、GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。红细胞的供能方式主要之一就是无氧糖酵解，应该说也会含有GAPDH，是否失去了内参意义，这个可能还需要进一步查文献(我个人不是做这方面的，所以不能肯定地回答你)；

4、如果内参没有选择错误，而只是内参不齐的话，那说明你的蛋白定量有问题，只需要根据内参的IOD做一下上样量的调整就可以了。

灌注缺血缺氧模型不能用GAPDH做内参，换一个吧，β-actin，或者tubulin

因为缺血缺氧会导致GAPDH表达不稳定，在某些特定的细胞中表达会增高，不同的实验条件以及不同的组织要选择不一样的内参

有些文献里用GAPDH作内参是因为有些信号通路等目的蛋白分子量与actin接近。我们实验室有的人做心肌组织和细胞内参GAPDH和actin都用过，记得我看到都很齐，缺氧再灌模型心和脑也用过actin、GAPDH，这方面我涉及的少，而我们偶尔提心肺组织蛋白都没灌流，也没仔细考虑过血细胞的问题，所以相应的这些方面具体你可以再咨询下这方面的同学或查查文献吧。再就蛋白放在-20度会降解，我们都放在-80冰箱的。至于压片子我们内参都5分钟，你压半小时应该是蛋白表达多少条带就多粗，这个应该没问题的。

-20度冰箱不能长期保存，蛋白会慢慢降解，有的蛋白-20度一周不到就降解，丽春红染色后条带也会弥散的。所以我们都是-80度保存，可以长期保存，一年后再拿出来跑western都行的。